細胞外小泡協議

使用離心過濾器僅需 40-60 分鐘即可富集細胞外囊泡。如果您對超速離心或沉澱方法製備外泌體和其他細胞外囊泡 (EV) 感到氣餒，請嘗試這個優於外泌體沉澱方法的快速方案。

部分概述

• 使用 Amicon^® Ultra Centrifugal Filters
• 步驟 1.樣品澄清
• 步驟 2.裝置平衡
• 步驟 3.樣品超濾（濃縮和緩衝液交換）
• 相關產品

Enrichment of the Microvesicle Fraction from Cell Culture Supernatant Using Amicon^® Ultra Centrifugal Filters

接下來的這個方案是設計用來從無血清細胞培養基中富集細胞外小泡 (EVs)。過程包括使用Steriflip^®裝置進行真空過濾，預先澄清樣品（去除細胞和細胞碎片）。濾過的樣品再使用 Amicon^® Ultra (AU) 過濾器 (10 kDa MWCO) 離心濃縮。進行第二次旋轉，通過離心重過濾進行樣品清理和緩衝液交換。最後的濃縮樣品即可用於下游分析或應用。

註：所有四種尺寸的 Amicon^® Ultra 過濾器（0.

注意：我們建議使用無血清培養基，以避免在胎牛血清（FBS）中濃縮過量的白蛋白。如果不擔心白蛋白，則可將此方案用於含血清的樣品。

注意：FBS 也含有外泌體，可能會干擾某些下游分析。不含外泌體的培養基，如 Exo-FBS™ Exosome depleted 培養基（System Biosciences），仍會含有白蛋白。

Step 1.樣品澄清

1. 將上清液培養基從細胞培養瓶轉移到 50 mL 帶螺紋的錐形管中。
2. 將Steriflip^®單元 （0.22 µm Millipore Express (PES)膜）擰入樣品管的頂部開口端。
3. 將組件倒置並固定在試管底座或試管架上。
4. 將調節真空源連接到 Steriflip^® 裝置側面的真空端口。開啟真空將溶液抽過膜，並注入空管中。
5. 取下 Steriflip^® 裝置，並蓋上樣品。

所概述的離心超濾方案是基於使用 AU-15過濾器（10 kDa MWCO）處理15 mL樣品（最大容量）。如果使用不同容量或設備格式（AU-0.5、-2 或 -4）的過濾器，請參考相應的 Amicon^® Ultra 過濾器用戶指南。5, -2, or -4 mL）。

Step 2.裝置平衡

6. 在裝置中加入 2 mL PBS，蓋上蓋子，在擺動桶轉子中以 4,000 x g 離心 10 分鐘。

• 對於 AU-2 和 4，可以使用相同的離心速度。如果要使用固定角度的轉子，請參閱設備用戶指南以瞭解適當的速度和體積限制。
• 對於 AU-0.5，樣品在可容納 1.5 mL 管的固定轉子中以 14,000 x g 離心。

7. 從過濾器底部取出未過濾的 PBS。從收集管吸出濾液。

• 對於AU-2、4和15裝置，將移液管(p200)插入過濾裝置底部，以側向橫掃動作抽取樣品以確保完全去除濾液。在繼續之前，從收集管吸出 PBS 或接上乾淨的微離心管。

步驟 3.樣品超濾（濃縮與緩衝液交換）

AU-15過濾器，並蓋上裝置蓋子。
1. 以 4,000 x g 離心 30 分鐘。
   注意：平均而言，這將產生 500 µL (30 倍濃度) 的最終樣品。然而，視樣品的性質而定，流速以及達到所需濃度所需的離心時間會有所不同。有關處理較小容量的估計，請參閱個別 Amicon^® Ultra 過濾器用戶指南。
2. 將裝置從離心機中取出，清空收集管。以 4,000 x g 離心 30 分鐘。
3. 從過濾裝置回收濃縮的樣品。

• 對於 AU-2、-4 和-15 裝置，插入移液器 (p200)，抽取一定量的樣品 (200 µL)，多次沖洗膜側壁（每邊 3-4 次）以確保完全回收。從過濾器底部回收樣品體積
• 對於AU-0.5，將過濾器倒置於乾淨的微離心管中。以 2,000x g 離心 1 分鐘，將樣品轉移到試管中（反向旋轉）。

13. 細胞外囊泡樣品已準備好進行分析。