使用 Amicon® Pro 離心式過濾器去除洗滌劑
在純化過程中，去垢劑常用於溶解蛋白質和核酸，但去垢劑的存在可能會干擾下游分析。游離的去垢劑可以用各種方法去除1；然而，與大分子非共價結合的去垢劑分子可以被移除，但無法完全去除。
Amicon® Pro 離心過濾器是從蛋白質或核酸溶液中去除去垢劑的有效工具。過濾器的選擇取決於特定去垢劑的臨界膠束濃度 (CMC)。當濃度高於 CMC 時，洗滌劑單體會形成膠束聚集體，分子結構會發生嚴重變化。
然而，要選擇一個NMWL允許洗滌劑通過，但不允許相關蛋白質通過的超濾設備，可能會很有挑戰性。因為它們會形成大型膠束，所以許多去垢劑需要使用 NMWL 高達 100 kDa 的膜來進行大小去污，導致樣品中感興趣的蛋白質流失。使用孔徑較小的超濾器來處理這些去垢劑的方法之一，就是先透過樣品稀釋來減少膠束的形成。
Amicon® Pro 系統使用連續重過濾來去除去垢劑，在連續重過濾的過程中，恒定的樣品體積會被不含去垢劑的緩衝液持續洗滌。與使用非連續重過濾或透析相比，此方法能更有效地去除洗滌劑，且蛋白質回收率更高。使用 Direct Detect® 紅外線光譜儀可以同時監測去垢劑的去除和蛋白質的回收。
有關去垢劑去除監測方法的更多資訊，請參閱我們的出版物， 使用中紅外（MIR）光譜分析蛋白質樣品中的去垢劑。
方法
- 必要時，使用 Steriflip® 0.45 µm 過濾器或 Millex® 0.
- 使用 Direct Detect®分光儀 估算起始材料中去滌劑和蛋白質的濃度。請參閱 Direct Detect®用戶指南以及我們的 出版物，瞭解使用相關去垢劑的 8 點稀釋和儀器軟體的 「脂質校準精靈 」校準光譜儀的詳情。
- 將 50-100 µL 此樣品加入 Amicon® Ultra 0.5 mL 过滤器（包含在 Amicon® Pro 系统中）
- 将过滤器连接到 Amicon® Pro 交换装置上。
- 在交换装置/Amicon® Ultra 0.5 mL 过滤器组件中加入 1 mL 磷酸盐缓冲生理盐水。完全組裝 Amicon® Pro 裝置。
（Amicon® Pro 裝置可安全容納高達 9 mL 的緩衝液。
(Amicon® Pro 裝置可安全容納多達 9 mL 的緩衝液，但只需加入 1.0 mL 的新鮮緩衝液，就能有效地進行 1000 倍的緩衝液交換，因為持續重過濾能讓樣品不斷接觸到新鮮、不含洗滌劑的緩衝液。) - 在搖擺桶轉子中以 4,000 x g 離心 30 分鐘。
- 取出並拆開 Amicon® Pro 裝置。
- 將 Amicon® Ultra 0.
- 將 Amicon® Ultra 0.5 mL 收集管置於 Amicon® Ultra 0.5 mL 過濾器的頂部，並倒置。
- 將樣品放入固定角度的轉盤中，以 1,000 × g 的速度旋轉 2 分鐘，以回收樣品。
- 如步驟 2 般使用 Direct Detect® 光譜儀估算回收蛋白的濃度，並確認去清劑置換。
使用 Amicon® Pro 系統去除去垢劑的結果範例
從 2 mg/mL IgG 中去除 0.5% 脱氧膽酸钠。 使用溶解在 0.5% 脱氧膽酸钠中的 2 mg/mL IgG，Amicon® Pro 純化系統被用來展示稀釋到其 CMC 以下的洗滌劑可以很容易地被基於尺寸的超濾方法去除。
下圖比較了通過連續重過濾與連續稀釋和濃縮步驟去除洗滌劑的效果。連續重過濾使游離洗滌劑的濃度低於臨界膠束濃度 (CMC)。
連續重過濾還能避免在不含去垢劑的緩衝液中過快地濃縮蛋白質，因為此過程可能會破壞去垢劑與蛋白質之間的穩定互動，導致蛋白質沉澱，降低產率。
在去除洗滌劑的過程中，測量洗滌劑去除率和蛋白質回收率，使我們有可能找出能使這兩個過程達到最佳平衡的方案。
從 50 µL 蛋白樣品中去除去垢劑，同時監測去垢劑去除百分比 (A) 以及蛋白質回收百分比 (B)。灰條反映的是使用 10 倍、20 倍和 30 倍容量的無去垢劑緩衝液進行連續重過濾去除去垢劑的結果，而黑條反映的是先將樣品稀釋 10 倍、20 倍或 30 倍，然後再進行超濾濃縮去除去垢劑的結果。請注意，當樣品只稀釋 10 倍時，傳統的超濾濃度並沒有去除樣品中的任何去垢劑 (A)。
參考資料
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