簡介
本檢測方案適用於使用苯丙氨酸檢測試劑盒（MAK005）對細胞和組織培養上清液、尿液、血漿、血清和其他生物樣本中的苯丙氨酸進行比色/螢光檢測。苯丙氨酸濃度是透過耦合酵素分析法來測定，苯丙氨酸脫氨基後產生 NADH，NADH 與探針反應產生螢光 (λex = 535/λem = 587 nm) 產物，與存在的苯丙氨酸成正比。該檢測的線性檢測範圍在 0.2-1.0 nmole 之間。
試劑
苯丙氨酸分析緩衝液 ； 25 mL
Catalog Number MAK005A
Tyrosinase
目錄編號 MAK005B
Enzyme Mix 1 vl
商品編號 MAK005C
Developer ；1 vl
目錄編號 MAK005D
苯丙氨酸標準，10 µmole 1 vl
目錄編號 MAK005E
需要但不提供的試劑和設備
96孔平底板 - 建議使用黑色透明底板進行螢光檢測（目錄編號M5686 或同等產品）。
螢光多孔平板閱讀器
10 kDa 分子重量截斷（MWCO）旋轉過濾器（目錄編號 Z706345 或同等產品）
製備說明
開瓶前將小瓶簡單離心。使用超純水製備試劑。
Phenylalanine Assay Buffer - 使用前讓緩衝液達到室溫。
Tyrosinase, Enzyme Mix, and Developer - Reconstitute each in 220 µL of Phenylalanine Assay Buffer.用移液器充分混合，然後等分並儲存於 -20 °C。使用時保持低溫並避光。
苯丙氨酸標準液 - 用 100 µL 水重製成 10 mM (10 nmole/µL) 苯丙氨酸標準液。用移液管攪拌均勻，然後等分並儲存於 -20 °C。使用時保持低溫。
儲存/穩定性
試劑盒以濕冰發運。
程序
所有樣品和標準品應一式兩份。
用于荧光检测的苯丙氨酸标准溶液
用990 µL水稀释10 µL的10 mM苯丙氨酸标准溶液，制备
0.1 mM (0.1 nmole/µL)标准溶液。在 96 孔板中加入 0、2、4、6、8、10 µL 的 0.1 mM 苯丙氨酸標準溶液，產生 0（空白）、0.2、0.4、0.6、0.8 和 1.0 nmole/ 孔標準。
樣品準備
血清樣品在用於檢測前應使用 10 kDa MWCO 旋轉過濾器進行去蛋白處理。10-50 µL 去蛋白血清樣品可直接用苯丙氨酸檢測緩衝液稀釋至 50 µL 的最終容量。
組織（20 mg）或細胞（1 x 106）可在 100 µL 苯丙氨酸檢測緩衝液中均質化。以 13,000 x g 離心 10 分鐘以去除不溶物。用苯丙氨酸分析緩衝液使樣本達到 50 µL 的最終容量：
對於未知樣品，建議測試幾個樣品稀釋液以確保讀數在標準曲線的線性範圍內。
樣品中的NADH和NADPH可能產生背景信號。
樣品中的酪氨酸可能產生背景信號。為控制酪氨酸的干擾，可在檢測開始前用 5 µL 酪氨酸酶在室溫下預先處理樣本 10 分鐘。相应调整反应混合物中苯丙氨酸检测缓冲液的浓度（见表 1）。
检测反应
1. 根据表 1 中的方案设置反应混合物。每個反應（孔）需要 50 µL 適當的 Reaction Mix。
2.向空白孔、標準孔和測試孔各加入 50 µL 適當的 Reaction Mix。使用水平搖床或移液器充分混勻，在 37 °C 下孵育 20 分鐘。
3. 測量螢光強度 (λex = 535/λem = 587 nm)。
結果
計算
檢測的背景是 0（空白）苯丙氨酸標準品所獲得的值。通過從所有讀數中減去空白值來校正背景。背景值可能很顯著，必須從所有讀數中減去。使用從適當苯丙氨酸標準品中獲得的值繪製標準曲線。
注意: 每次進行檢測時都必須建立新的標準曲線。
從樣品讀數中減去樣品空白值，獲得校正測量值。使用校正後的測量值，可根據標準曲線確定樣品中苯丙氨酸的含量。
苯丙氨酸的濃度
&pnbsp; Sa/Sv = C
Sa ；= 由標準曲線得出的未知樣品中苯丙氨酸的量(nmole)
Sv = 加入孔中的樣品容量(µL)
C = 樣品中苯丙氨酸的濃度
苯丙氨酸分子量：165.02 g/mole.
樣品計算
苯丙氨酸的量 (Sa) = 5.84 nmole
樣品容量 (Sv) = 50 µL
樣品中苯丙氨酸的濃度
5.84 nmole/50 µL = 0.1168 nmole/µL
0.1168 nmole/µL x 165.02 ng/nmole= 19.3 ng/µL
注意事項和免責聲明
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