測定丙氨酸的酶法（丙氨酸分析法）

本檢測方案適用於使用丙氨酸檢測試劑盒（MAK001）對細胞和組織培養上清液、尿液、血漿、血清和其他生物樣本中的丙氨酸進行比色/螢光檢測。丙氨酸濃度由耦合酶分析法測定，其結果為比色法（570 nm）/氟化法（_λex =535/_λem =587 nm）產品，與存在的丙氨酸成正比。本試劑盒的典型檢測範圍為 2-10 nmole（比色法）和 0.2-1 nmole（螢光法）。

部分概述

• 注意事項和免責聲明
• Reagents
• Reagents and Equipment Required but Not Provided
• 方法
• 相關產品

注意事項和免責聲明

本產品僅供 R&D 使用，不得用於藥物、家庭或其他用途。請參閱安全資料表，以瞭解有關危害和安全處理實務的資訊。

試劑

• 25 mL 丙氨酸分析緩衝液
• 0.2 mL 丙氨酸探針，DMSO中
  
• 1 vl 丙氨酸轉換酶
  
• 1 vl 丙氨酸顯影混合液
• 0.1 vl 丙氨酸標準品，10 µmole
  

需要但不提供的試劑和設備

• 96孔平底板 - 建議使用黑色透明底板（M5686 或同等產品）進行螢光檢測，透明板（M4436 或同等產品）進行比色檢測。
• 螢光或分光光度法多孔平板閱讀器
• 10 kDa 分子重量截斷（MWCO）旋轉過濾器（Z706345 or equivalent)

製備說明

開瓶前將小瓶簡單離心。使用超純水製備試劑。

丙氨酸分析緩衝液 - 使用前讓緩衝液達到室溫。

丙氨酸探針 - 使用前加熱至室溫，使冷凍溶液融化。在 -20 °C 下避光防潮保存。

對於螢光檢測，在使用前用丙氨酸檢測緩衝液稀釋比色丙氨酸探針溶液的等分量 5 到 10 倍。

丙氨酸轉換酶 - 用 220 µL 丙氨酸分析緩衝液重構。用移液管攪拌均勻，然後等分並儲存於 -20 °C。使用時保持低溫並避光。

丙氨酸顯影混合物 - 用 220 µL 丙氨酸分析緩衝液重構。用移液器攪拌均勻，然後等分並儲存於 -20 °C。

丙氨酸標準液 - 用 100 µL 水重製成 100 mM (100 nmole/µL) 丙氨酸標準液。用移液管攪拌均勻，然後等分並儲存於 -20 °C。

儲存/穩定性

試劑盒以濕冰運送。

操作步骤

所有样品和标准品应一式两份。

比色法檢測丙氨酸標準液

用990 µL水稀釋10 µL 100 mM (100 nmole/µL)丙氨酸標準液，製備1 mM (1 nmole/µL)標準液。在 96 孔板中加入 0、2、4、6、8、10 µL 的 1 mM 丙氨酸標準溶液，產生 0（空白）、2、4、6、8 和 10 nmole/ 孔標準。每孔加入丙氨酸分析緩衝液，使容量達到 50 µL。

丙氨酸標準液的螢光檢測

製備 1 mM 標準液，與比色法相同。取 100 µL 1 mM 丙氨酸標準溶液，加入 900 µL 水，製成 0.1 mM 丙氨酸標準溶液。在 96 孔板中加入 0、2、4、6、8、10 µL 的 0.1 mM 丙氨酸標準溶液，生成 0（空白）、0.2、0.4、0.6、0.8 和 1.0 nmole/ 孔標準。

樣品準備

比色法和螢光法檢測每個反應（孔）都需要 50 µL 樣品。

血清樣品在檢測前應使用 10 kDa MWCO 旋轉過濾器去蛋白。

組織或細胞（1 x 10⁶）可在 100 µL 丙氨酸分析緩衝液中均質化。以 13,000 x g 離心 10 分鐘以去除不溶物。

注意：血清以外的樣品也可以在加入反應前用 10 kDa MWCO 旋轉過濾器去蛋白質。

對於未知樣品，建議測試幾個樣品稀釋本，以確保讀數在標準曲線的線性範圍內。

在反應混合物中省略丙氨酸轉換酶，為每個樣品加入空白樣品。

分析反應

1. 根據下表中的方案設置反應混合物。每個反應（孔）需要 50 µL 適當的反應混合物。

空白樣品	樣品及標準
丙氨酸分析緩衝液	46 µL	44 µL
丙氨酸轉換酶	-	2 µL
丙氨酸顯影混合液	2 µLL	2 µL
丙氨酸探針	2 µL	2 µL

2. 在空白孔、標準孔和測試孔中各加入 50 µL 適當的反應混合物。使用水平搖床或移液器充分混勻，然後在 37 °C 下孵育 60 分鐘。孵育期間應避免光線照射。
3. 比色法檢測時，在 570 nm (A₅₇₀) 處測量吸光度。對於螢光檢測，測量螢光強度（_λex = 535/_λem = 587 nm）

。

結果

計算

檢測的背景是 0（空白）丙氨酸標準品所獲得的值。通過從所有讀數中減去空白值來校正背景。背景值可能很顯著，必須從所有讀數中減去。使用從適當丙氨酸標準品中獲得的值繪製標準曲線。

注意：每次進行檢測時都必須建立新的標準曲線。

從樣品讀數中減去空白樣品值，獲得校正測量值。使用校正後的測量值，可根據標準曲線判定樣品中丙氨酸的含量。

丙氨酸濃度

S_a/S_v ；= C

S_a = 根據標準曲線測得的未知樣品中丙氨酸的量 (nmole)

S_v = 加入孔中的樣品體積 (µL)

C = 樣品中丙氨酸的濃度

L-Alanine molecular weight：89.09 g/mole.

樣品計算

丙氨酸的數量 (S_a) = 5.84 nmole

樣品容量 (S_v) = 50 µL

樣品中丙氨酸的濃度

5.84 nmole/50 µL = 0.1168 nmole/µL

0.1168 nmole/µL x 89.09 ng/nmole=10.4ng/µL

。

圖 1. ColorImetric 標準曲線。

圖 2. 螢光標準曲線。