脂肪酶活性测定实验方案

原理

用分光光度法在545 nm处测量醌亚胺染料的外观。

单位定义

一个单位指在下述条件下每分钟导致形成一微摩尔甘油（半微摩尔醌亚胺染料）所需要的酶量。

方法

试剂

A. 橄榄油乳剂	：将5.0 g橄榄油 [试剂级（高度精制，低酸度）] 和5.0 mL 5.0％ Triton X-100溶液（B）的混合物超声处理10分钟（20 KHz）。向油乳剂中加入25 mL 4.0％ BSA溶液（C）和15 mL 0.1 M K磷酸盐缓冲液，pH 7.0（D），并混合。（应该现配现用）
B. Triton X-100溶液	：5.0%（ 5.0 mL Triton X-100/100 mL的H2O）
C. BSA溶液	：4.0％ [ 4.0 g牛血清白蛋白/100 mL的H2O ]
D. K-磷酸盐缓冲液，pH7.0	0.1 M
E. TCA溶液	：0.2 M（33 g三氯乙酸 / 1,000 ml H2O）
F. MES-NaOH缓冲液	：50 mM MES缓冲液，pH 6.5 [ 将9.76 g 2-（N-吗啉代）-乙磺酸 酸（MW = 195.23）溶解于大约850mL H2O中，用5.0 N NaOH调节pH至6.5，最后用H2O定容至1,000 mL ]
G. 显色剂	：按以下顺序，将下列化学品和酶溶于200 mL 50 mM MES缓冲液 （F）中：
4.0 mL 0.04 mL 4.0 mg 24.2 mg 40.7 mg 200单位 500单位 300单位	Triton X-100溶液（B） N,N-二乙基-间甲苯胺（搅拌至完全溶解） 4-氨基安替比林 ATP・Na2・3H2O MgCl2・6H2O 甘油激酶 L-α-甘油磷酸氧化酶 过氧化物酶（红棓酚单位）
	（如果在4 ℃下储存在琥珀色瓶中，可稳定保存一周）
H. 酶稀释剂	：20 mM K-磷酸盐缓冲液，pH 7.5，含有2.0 mM MgCl2和0.5 mM EDTA-Na3

操作流程

（第1步）

1. 将2.0 mL橄榄油乳剂（A）吸移到试管中，在37 ℃下平衡约5分钟。

测定混合物中各成分的浓度
K-磷酸盐缓冲液	29.1 mM
橄榄油	90.9 mg/mL
MgCl2	0.18 mM
Triton X-100	9.1 %
EDTA	45 μM
BSA	1.8 %

2. 加入0.2 mL酶溶液*并混合。
3. 在37 ℃下反应15分钟后，加入2.0 mL TCA溶液（E）以终止反应，并用滤纸（Toyo-Roshi No.131或Whatman No.42）过滤除去沉淀物。
   

（第2步）

4. 将所获得的0.05 mL滤液转移到试管中。
5. 加入3.0 mL显色试剂（G），37 ℃下孵育15分钟。
   
6. 对照水，测量545nm处的光密度（OD测试）。
   

与此同时，制备空白试剂：在37 ℃下用2.0 mL TCA溶液孵育15分钟后，首先混合2.0 mL橄榄油乳剂（A），然后加入酶溶液（第1步）。使用从混合物获得的滤液，按照与测试相同的程序步骤进行第2步，并测量545nm处的光密度（OD空白）。

* 将酶制剂溶解于冰冷的酶稀释剂（H）中，并在测定前立即用相同的缓冲液稀释至0.4 - 1.2 U/mL。

计算

可以使用以下公式计算活性：

重量活性（U/mg）=（U/mL）×1/C

Vt-1	：第1步总体积（4.2 mL）
Vt-2	：第2步总体积（3.05 mL）
Vs-1	：样品体积（0.2 mL）
Vs-2	：第2步中的样品体积（0.05 mL）
28.2	：测定条件下醌亚胺染料的毫摩尔消光系数（F/微摩尔）
1/2	：基于1摩尔H2O2产生半摩尔醌亚胺染料的换算系数
1.0	：光程长度（cm）
t	：第1步的反应时间（15分钟）
df	：稀释因子
C	：溶解时的酶浓度（c mg/mL）

此操作方案仅供参考。