α-澱粉酶（EC 3.2.1.1）的酵素分析

概述：α-淀粉酶活性的測定

本程序可用於測定α-淀粉酶活性。

分光光度法停止反應測定（A₅₄₀，光路 = 1 cm）基於以下反應：

單位定義：在 pH 6.9 和 20 °C 的條件下，一個單位可在 3 分鐘內從澱粉中釋放出 1.0 毫克麥芽糖。

所需試劑和設備

磷酸鈉，單鹽基型，產品編號 S9888

馬鈴薯澱粉，產品編號 S2004

氫氧化鈉，產品編號 S5881

酒石酸鈉鉀，四水，產品編號 S2377

3,5-二硝基水楊酸，產品編號 D0550

D-(+)-Maltose, monohydrate, Product Number M9171

注意事項

請參閱安全資料表，以瞭解有關危害和安全處理實務的資訊。

製備說明

試劑的製備使用超純水（25 °C時電阻率≥18 MΩ×cm ）。

緩衝溶液（20 mM 磷酸鈉與 6.7 mM 氯化钠，pH 6.9，20 ℃） - 配制含有 2.4 mg/mL 磷酸一钠，产品编号S0751，和 0.39 mg/mL的氯化鈉，產品編號S9888，在超純水中。  使用1 M NaOH/1 M HCl在20 °C下調整至pH 6.9。

淀粉溶液 [1.0% (w/v) 可溶性淀粉溶液] - 使用來自馬鈴薯的淀粉（產品編號S2004）在緩衝液中製備 10 mg/mL 的溶液：

• 在加熱/攪拌板上沸騰 15 分鐘，混和溶解溶液。
• 移離加熱器。
• 用超純水使溶液達到最終容量。
• 在整個檢測過程中繼續攪拌溶液。

2 M 氫氧化鈉 (NaOH) 溶液 - 使用氫氧化鈉（產品編號 S5881）在超純水中製備 80 mg/mL 溶液。3 M 酒石酸鉀鈉（四水合物）溶液 - 在 2 M 氫氧化鈉（NaOH）溶液中製備 1,496 mg/mL 的酒石酸鉀鈉（四水合物）溶液，產品編號S2377。 在加熱/攪拌盤上加熱並攪拌溶解固體。 不要 不要 加熱至沸騰！

96 mM 3,5-二硝基水楊酸溶液 - 使用 3,5-二硝基水楊酸製備 21.9 mg/mL solution using 3,5-Dinitrosalicylic acid, Product Number D0550， in ultrapure water.  Dissolve solids by heating on a heating/stir plate with mixing. 不要 加熱至沸騰！

彩色試劑溶液 - 配製 40 mL 時， 加入：

• 12.0 mL 温（50-70 ℃）超纯水至适当规格的琥珀色瓶中。
  在搅拌下，缓慢加入：
• 8.0 mL 温 5.3 M 酒石酸鉀鈉四水合物溶液
• 20 mL 的 溫 96 mM 3,5-二硝基水楊酸溶液

如果避光，此溶液在環境溫度下可穩定 6 個月。如有需要，可調整配備的體積。

0.2% (w/v) 麥芽糖標準 - 使用 D-(+)-麥芽糖、一水合物、產品編號 M9171，在容量瓶中以超純水配備 2 mg/mL 溶液。

α-Amylase 樣品溶液 - 使用前立即製備含 0.75-1.5 units/mL 的 α-Amylase 於 20 ℃ 超純水中。

程序

最終檢測濃度 - 在 2.00 mL 反应体积中，最终浓度为 0.50% (w/v) 淀粉和 ~1 单位的 α 淀粉酶。

1. α 淀粉酶样品测定

a.用移液管將下列試劑（以 mL 為單位）移入適當的容器中：

樣品 2	空白樣品
淀粉溶液	1.00	1.00	1.00	1.00

b.旋轉混合並平衡至 20 °C。  然後加入（以 mL 為單位）：

樣品2
α-Amylase 樣品	0.50	0.70	1.00	-

c.旋轉混合，並在 20 ℃ 培養 3.0 分鐘。

樣品 2	空白樣品
Color Reagent	1.00	1.00	1.00	1.00

d.用通風的蓋子蓋上容器，放入沸水浴中煮  xactly 15 minutes.

e.從沸水浴中取出容器。然後加入（以 mL 為單位）：

樣品2
α-Amylase 樣品	0.50	0.30	-	1.00

f.在冰上冷卻溶液至室溫。然後加入（以 mL 為單位）：

樣品 2	空白樣品
Ultrapure water	9.00	9.00	9.00	9.00

h.倒轉混合。用適當的分光光度計在 540 nm 處對空氣空白，並記錄 樣品 和 樣品空白的 A₅₄₀ 。

2.標準曲線製備

a.用移液管（以 mL 為單位）將下列試劑注入適當的容器中，製備標準曲線：

Reagent	STD1<	STD2	STD3	SDD4	STD5	STD6	STD7	STD BLK
0.2% (w/v) 麥芽糖標準	0.05	0.20	0.40	0.60	0.80	1.00	2.00	-
Ultrapure water	1.95	1.80	1.60	1.40	1.20	1.00	-	2.00
彩色試劑	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00

注意： 可根據需要添加額外的標準液位。

b.將容器蓋上通氣蓋，放入沸水浴中 15 分鐘。從沸水浴中取出容器。在冰上冷卻溶液至室溫。然後加入（以 mL 為單位）：

STD1	SDD2	SDD3	SDD4	STD5	STD6	STD7<	STD BLK
9.00	9.00	9.00	9.00	9.00	9.00	9.00	9.00

e.倒轉混合。用適當的分光光度計在 540 nm 處對空氣空白，並記錄 標準 和 標準空白的 A₅₄₀ 。

結果

計算

1. 決定每個 標準 vs. 的ΔA₅₄₀ 。 標準空白。
   ΔA_{540 (Standard)} = A_{540 (Standard)} -A_{540（標準空白）}
2. 將標準品的ΔA₅₄₀ vs.
3. 使用線性迴歸法確定每個 樣品 對比 空白樣品的ΔA₅₄₀  。
   ΔA_{540 (Sample)} = A_{540 (Sample)} - A_{540 (樣品空白)}
4. 使用標準曲線測定釋放的麥芽糖毫克數。
   
   
5.    

。

其中：
df = 稀釋因子
mL enzyme  = 步驟 1b 中加入的 mL 樣品。

參考資料

1. Bernfeld P. 1955. [17] Amylases, ? and ?.149-158. https://doi.org/10.1016/0076-6879(55)01021-5