纖維素酶的酵素分析

2.範圍

本程序適用於所有纖維素酶和半纖維素酶產品。

3. 定義

3.1 方法：分光光度法停止速率測定

3.2 條件：T = 37 °C, pH = 5.0, Abs340nm, 光路 = 1 cm

3.3 ATP = 腺苷 5「-Triphosphate

3.4 ADP = 腺苷 5」-Diphosphate

3.5 β-NAD = β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，氧化型

3.6 β-NADH = β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，还原型

3.7 G-6PDH = Glucose 6-Phosphate Dehydrogenase

3.8 G-PG = 6-Phospho-D-Gluconate

3.9 Cellulose + H2O Cellulase> D-Glucose

3.10 D-Glucose + ATP Hexokinase> D-Glucose 6-Phosphate + ADP

3.11 D-Glucose 6-Phosphate + β-NAD G-6PDH> 6-PG + β-NADH

3.12 單位定義：在 pH 5.0、37 ºC（孵育時間 2 小時）的一個小時內，一個單位將從纖維素中釋放出 1.0 μmole 葡萄糖。

3.13 最終檢測濃度：在 5.00 ml 的反應混合物中，最終濃度為 40 mM 醋酸鈉、4% (w/v) Sigmacell 和 2-6 個單位的纖維素酶。

5.責任

經過訓練的分析服務人員、新產品支援人員和研發人員有責任按照書面規定遵守本程序。

6.安全

請參閱安全資料表 (SDS)，瞭解危害和適當的處理預防措施。

7.程序

7.

7.1 試劑

產品編號	說明
S8625。	醋酸鈉，三水
H3162	1N鹽酸
S3504	1 N 鹽酸
G3293	葡萄糖 (HK) 分析試劑

7.2材料/設備

拋棄式、硼硅玻璃、培養管
可調式容量空氣移液管及吸頭
平衡
渦輪
震動槽
37 ºC 烤箱
分光光度計
分光光度計比色皿
離心機

7.3 相關作業程序

N/A

7.4 溶液製備

7.4.1    50 mM Sodium Acetate Buffer, pH 5.0 at 37 ºC

7.4.1.1    用 1.36 g Sodium Acetate, Trihydrate, Prod.S8625。在 37 ºC 下用 1N HCl, Prod.H3162.

7.4.2   5% (w/v) Sigmacell Solution (Sigmacell)

7.4.2.1    用 5 g Sigmacell Microcrystalline Type 20, Prod.S3504。混和並輕輕加熱，使成均勻的懸浮液。

7.4.3   葡萄糖（HK）測定瓶

7.4.3.1   使用葡萄糖（HK）分析試劑，Prod.G3293。

7.4.4   纖維素酶溶液（纖維素酶）

7.4.4.1   使用前，立即用去離子冷水配製含 2-6 單位/毫升纖維素酶的溶液。

7.5 測試方法

7.5.1   用移液管（以毫升計）將下列物質移入拋棄式硼硅玻璃培養管中：

測試	空白
Sigmacell	4.00	4.00

7.5.1.1    平衡至 37 °C。

7.5.1.2     Then add:

測試	空白
Cellulase	1.00	----
去離子水	----	1.00

7.5.1.3      立即攪拌混和測試和空白對照。Using a shaker bath incubate both the Test and Blank at 37 ºC for exactly 120 minutes with moderate shaking.

7.5.1.4    Immediately transfer both the Test and Blank into an ice bath.讓兩者靜置，直到懸浮液沉澱。以約 4000 rpm 離心約 2 分鐘以澄清。將上清液用於步驟 7.5.2.2：

7.5.2     移取下列液體（以毫升計）至適當的比色管中：

7.5.2     

Reagent	測試	空白
葡萄糖（HK）測定小瓶	3.00	3.00

7.5.2.1    平衡至 25 ºC。使用適當恆溫的分光光度計監測 A_340nm 直到恒定。記錄測試品和空白品的初始 A_340nm .

7.5.2.2     然後加入：

7.5.2.3        

試劑	測試	空白
測試上清液 (步驟 7.5.1.4)	0.10	----
空白上清（步驟 7.5.1.4)	----	0.10

7.5.2.3    立即倒轉混合，並記錄 A_340nm 的增加，直到完成（約 5 分鐘）。獲得測試和空白的最終 A_340nm 

7.6 計算

7.6.1    ΔA_340nm Test = A_340nm Test Final - A_340nm Test Initial

7.6.2    ΔA_340nm Blank = A_340nm Blank Final - A_340nm Blank Initial

7.

7．3	單位／毫升酵素=	(ΔA340nm Test - ΔA340nm Blank) (3.1) (5) (DF)
		(6.22) (2) (1) (0.1)

7.6.3.1    3.1 = Final volume (in milliliters) of step 7.5.2

7.6.3.2    5 = Total volume (in milliliters) of reaction mix of step 7.5.1

7.6.3.3    DF = 稀釋係數

7.6.3.4    6.22 = β-NADH 在 340nm 波長的毫摩尔消光系数

7.6.3.5    2 = 根據單位定義從 2 小時到 1 小時的換算因子

7.6.3.6    1 = 在步驟 7.5.1 中使用的纖維素酶的體積（毫升）

7.6.3.2.6.3.7    0.1 = 步驟 7.5.1 中的容量（毫升）用於步驟 7.5.2

7.

7．8	單位／毫克固體=	單位／毫升酵素<
		mg 固體/毫升酵素

8.參考文獻及附件

8.1 附件：報告表格

8.2 參考資料：Worthington, C.E. (1988) Worthington Enzyme Manual, pp76-79, Worthington Biochemical Corporation, Freehold, NJ

9.批准

本文件的審閱、批准和簽名將使用 DocCompliance (QUMAS) 以電子方式生成。如果需要附有簽名驗證的硬複本，請列印「供使用」複本。

材料

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