PCR Technologies Protocols Table of Contents
定量 PCR Protocols
雖然定量 PCR 使用與傳統 PCR 相同的基本概念，但反應的不同之處在於擴增子通常較小，並且使用額外的染料或標籤探針或引物間接偵測。
dPCR是一種相對較新的技術，每個平台和應用都有特定的要求（數位 PCR）。每個系統都有特定的協議，並由儀器製造商提供優良的支援。
Bio-Rad QX100 系統
Bio-Rad 數位液滴系統以油乳化技術為基礎，使用標準 96 孔板格式。每個樣品可分割成 20,000 個反應，每板共可產生 190 萬個反應。反應使用雙標示探針（Dual-Labeled Probes）設定，探針包含 5「 螢光標記和 3」 淬滅劑，是 qPCR 反應的標準。液滴閱讀器能夠讀取 FAM 和 HEX 通道中的端點螢光信號，允許每個樣品使用 2 個目標進行多重反應。
要求
- QX100 液滴產生器 (186-3002; Bio-Rad)
- QX100 液滴閱讀器 (186-3003; Bio-Rad)
- Semi skirted 96-well PCR plate (Eppendorf Cat# 951020362)
- Bio-Rad 2× ddPCR supermix (186-3010; Bio-Rad)
- 液滴生成油（186-3005；Bio-Rad）
- 試管架（186-3051；Bio-Rad）
- 8室試管（186-3008；Bio-Rad）
Rubber gaskets (placed over cartridge to create vacuum seal; 186-3009; Bio-Rad) - Pierceable foil heat seal (181-4040; Bio-Rad)
- Primers and probes(100 μM stocks)：可從 sigma-aldrich.com/oligos購買
樣本要求
- 模板質量： 模板應為高品質的純化gDNA，不含抑制劑。建議使用適當的限制性內切酶消化模板 gDNA（1 μg DNA/40 μL 反應），消化後在 65 °C 下加熱滅活 20 分鐘。
- 模板量： 每次實驗中包含的模板量取決於目標基因的相對豐度和液滴分離量。Bio-Rad ddPCR 系統將反應分為 20,000 個液滴，因此當目的基因為單一拷貝時，建議在 20 μL 反應中使用 100 ng gDNA。
http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/bulletin_6277.pdf
標準方案
按以下所述製備 20× 引物/探針混合物。標準 ddPCR 主混合物是 25 μL 的混合物，包括上述引物/探針混合物、模板 DNA 和 2× ddPCR 超級混合物。
使用 20 μL 製備好的 qPCR 樣品，然後在相鄰的孔中加入 70 μL 液滴生成油，將樣品裝入 8 腔盒中。橡膠墊片橫跨腔室頂部，以確保真空密封。每個 8 艙盒裝入 QX100 液滴產生器，每個樣品產生 20,000 個液滴。使用 50 μL 多道移液管，將產生的 40 μL 液滴轉移到 96 孔板上，並用可穿刺鋁箔熱封。將板放入熱循環器中，使用標準的 2 步 qPCR 熱循環條件，以 50%（3 °C/秒）的斜率進行熱循環。在運行熱循環條件之前，建議使用溫度梯度測試新的引物/探針組，以優化退火/延伸溫度。
熱循環後將平板載入 QX100 液滴閱讀器，使用 Quantasoft™ 軟體分析端點反應。
http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/bulletin_6277.pdf
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