使用 REDTaq^® DNA 聚合酶擴增基因組 DNA

REDTaq^® DNA Polymerase Products

REDTaq^® DNA Polymerase 是一種方便的包裝，除了引物、DNA 模板和水之外，還包括 PCR 反應所需的所有成分。

REDTaq^® DNA 聚合酶是Taq聚合酶與惰性紅色染料混合而成。染料可快速辨識已加入酵素的反應，並可目視確認是否完全混合。酵素以 1 單位/µL 提供，可提供更精確的容量測量，並減少浪費。使用 REDTaq^® DNA 聚合酶進行的反應與任何 PCR 混合物一樣。不需要額外的反應製備步驟或方案變更。這些配方可將 PCR 的等分樣本（5-10 µL）直接載入瓊脂質凝膠，而無需添加電泳載入緩衝液。惰性染料在 1% 琼脂糖凝膠中與 125 bp 片段以相同速率共遷移。由於反應混合物中不需要加入凝膠上載緩衝液，因此樣品可以重新進行擴增，例如在巢式 PCR 中。如有必要，可使用常規純化方法將染料從擴增子中去除。染料的存在對於自動 DNA 排序、結合酶介導的結合、核外溶 PCR 產品消化和轉換沒有影響。儘管可能存在例外情況，但染料在限制性酵素消化中通常是惰性的。

單位定義： 一個單位在 74 ℃ 下 30 分鐘內將 10 nmol 的總脫氧核苷酸三磷酸鹽結合到酸沉澱 DNA 中。

試劑

選擇所需的 PCR 試劑：

分離 MgCl2
不含一管 dNTPs	REDTaq® Genomic DNA Polymerase, with MgCl2 (D8312)	REDTaq® Genomic DNA Polymerase, without MgCl2 (D2812)

• PCR 級水（W1754）
• 稀釋至工作濃度的引物（10 µM 工作儲備液足以進行大多數測試）
• 待擴增的 DNA
• 專用移液管
熱循環器
• 無菌過濾器 移液管吸頭
• 無菌1.5 mL 螺旋蓋微量離心管 (CLS430909)
• PCR 管，請選擇下列其中一種以符合所需格式：
  • 獨立薄壁 200 µL PCR 管 (Z374873)
  • 條裝管，200 µL (Z374962)
  • 板
    • 96 孔板 (Z374903)<
    • 384孔板 (Z374911)
    • 板封
    • AlumaSeal^® 96薄膜 (Z721549)
• dNTP混合物，dATP、dCTP、dGTP和dTTP各10 mM（D7295，僅標準格式試劑需要）

步驟

TaqDNA聚合酶、模板DNA、引物和MgCl₂ 的最佳條件和濃度取決於所使用的系統。可能需要確定每個單獨組件的最佳條件。尤其是 REDTaq^® DNA 聚合酶、循環參數和 MgCl₂ 濃度。  建議滴定酶和 MgCl₂ 以確定最佳效率。 
 
     1.      將下列試劑依下列順序加入 0.2 或 0.5 mL PCR 管中：

最終濃度
Q.s.	-
5 µL	10X PCR Buffer	1X
1 µL	10 mM dNTP mix	10 mM dNTP mix	每種 dNTP 200 µM
- µL	0.1-0.5 µM
- µL	Forward primer	0.td width="132" valign="top「>反向引物	0.1-0.5 µM
2.5 µL	REDTaq® DNA Polymerase	0.05 units/µL
-  µL	200pg/µL
50 µL	總反應量

注意：PCR 緩衝液稀釋後的 MgCl₂ 最終濃度為 1.5 mM；對於某些應用，較高濃度的 MgCl₂ 可能是最佳的。如果需要，可額外添加最多 5.5 mM 的 MgCl₂。

    2.     3.      如果使用沒有加熱蓋的熱循環器，在每個試管頂部加入 50 µL 的礦物油，以防止蒸發。

注意：擴增參數會因引物和使用的熱循環器而異。可能需要針對個別引物、模板和熱回旋器來優化系統。
 
        常用循環參數：
     a.在 94 °C 下對模板進行 1 minute 的變性處理
        b. 在 94 °C 下對模板進行 1 minute 的變性處理。55 °C 退火 2 分鐘
        c.      72 ℃延伸 3 分鐘
 
            建議擴增 25-30 個循環。
 
    5.     The amplified DNA can be evaluated by agarose gel electrophoresis by loading 5-10 µL of the PCR reaction onto the gel without the addition of gel loading buffers.
 
注意：每 50 µL 反應必須加入至少 1.5 個單位的 REDTaq^® DNA 聚合酶，才能進行無負載的凝膠載入。在 1% agarose 凝膠中，紅色追蹤染料與 125 bp 片段共遷移。如果需要更強烈的追蹤染料，可以使用未使用的泳道來運行任何常見的追蹤染料。

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