抗體-酵素介導的熱啟動 PCR 協定

PCR 技術協議目錄

端點 PCR 協議

在 PCR 分析製備過程中，由於 PCR 引物與非特異模板的結合，以及使用其他引物分子作為模板所形成的引物二聚體，可能會發生非特異性擴增。本節中介紹的方案均採用控制 PCR 啟動，讓使用者在增加目標產量和特異性的同時，將非特異性擴增減至最低。

使用熱啟動 Taq DNA 聚合酶時，酶在加熱前保持非活性。熱啓動 DNA 聚合酶控制是通過對酶進行化學或抗體修飾來實現的。化學改造的熱啟動酵素需要長達 10 分鐘的活化時間，而抗體介導的熱啟動酵素則在 1 分鐘內活化。

JumpStart™ Taq DNA 聚合酶是一種抗體未活化的熱啟動酵素。在 PCR 的初始變性步驟中，抗體也會變性，並與 DNA 聚合酶解離，因此酶的活性得以恢復。由此產生的 PCR 具有更高的特異性和產率⁵。

設備

• 移液管分量從 1 到 200 μL
  
• 台式微量離心機

適當的分析設備

• 電泳設備
  
• UV透射光儀
  
• 替代的 PCR 產品分析系統

耗材

• 無菌過濾器無菌 1.5 mL 螺旋蓋微量離心管 (CLS430909)
• PCR 管和板：
  -   個別薄壁 200 μL PCR 管 ()Z374873 or P3114)
  -  ； Strip tubes, 200 μL (Z374962)
  •   96-well plates (Z374903)
  •   384孔板（Z374911）
• dNTP混合物，dATP、dCTP、dGTP和dTTP各10 mM（D7295）。
• 酶和緩衝液；檢閱 表 P2-1 為實驗選擇最佳試劑。
• 如果使用凝膠電泳進行 PCR 產品分析，通常需要 DNA 大小標記。根據 PCR 擴增子大小選擇適當的標記（圖 2-17）。

圖 P2-17. 透過琼脂糖凝膠解析 DNA 尺寸標準。

表 P2-1.熱啟動 DNA 聚合酶和緩衝區

Hot Start DNA Polymerase
Standard Format-Separate ComponentsReadyMix-Premixed PCR Master Mix
Containing MgCl2		分離MgCl2 (適用於 MgCl2 優化)	含 MgCl
含紅色染料，可直接 載入凝膠	透明配方 不含染料	透明配方 不含染料	透明配方 不含染料	含紅色染料，可直接 加載於凝膠上
JumpStart™ REDTaq® DNA 聚合酶 Cat.No. D8187	JumpStart™ Taq DNA Polymerase, with MgCl2 Cat.No. D9307	JumpStart™ Taq DNA Polymerase, without MgCl2 Cat.No. D4184	JumpStart™ Taq ReadyMix™ Cat.No. P2893	JumpStart™ REDTaq® ReadyMix™ Cat.No. P1107

• PCR 級水 (W1754 or dispense W4502 into 20 mL aliquots and freeze; use a fresh aliquot for each reaction)。
• DNA/cDNA模板：
  • cDNA反應稀釋1:10以檢測中度至高度表達的目標，或稀釋1:2至1:5以檢測罕見的轉錄本。
• 稀釋至工作濃度的前體（10 μM 工作儲備液適用於大多數檢測，但多重混合可能需要混合 100 μM 儲備液）。
  • 可根據 OligoArchitect Online（OligoArchitect分析設計），並可在此訂購。

方法

1. 將 DNA 聚合酶放在冰上或 -20 °C，在冰上解凍其餘的反應成分，渦旋混合（酵素除外），短暫離心並置於冰上。
2. 設置 PCR 反應：
   Tables P2-2A or P2-2B) 。計算所需的混合母液，將數量乘以所需的反應次數（包括對照），然後再加上 10%，以確保所有樣品都有足夠的數量。

表 P2-2A.標準格式熱啟動 DNA 聚合酶的反應混合母液成分。

Component	Final Concentration (in a 25 μL Reaction)	每單一 25 μL 反應的主混合物容量 (μL)
PCR 緩衝液 (10×)	1×	2.5
Magnesium chloride (50 mM)*	2.5 mM	1.25
正向/反向引物 (10 μM stock)	50-500 nM	0.1 to 1
dNTP 混合物（每種 核苷酸 10 mM）	0.2 mM	0.5
Taq DNA 聚合酶 (5 U/μL)	0.05 單位/μL	0.25
PCR 級水	最高 20 μL	最高 20

* 注意： 如果 PCR 緩衝液中沒有氯化鎂，或者之前的優化顯示需要更高的濃度時，則需要單獨添加氯化鎂。

表 P2-2B.ReadyMix格式熱啟動DNA聚合酶的反應母液混合成分。

Component	Final Concentration (in a 25 μL Reaction)	每單一 25 μL 反應的主混合物容量 (μL)
JumpStart Taq ReadyMix (2×)	1×	12.5
正向/反向引物 (10 μM stock)	50-500 nM	0.1 to 1
PCR 級水	最高 20 μL	最高 20

      b. 在冰上將反應組份混合到 1.5 mL 微離心管中。

3. 小心地上下移液混合反應母液，確保所有混合液都從移液管尖端排出，然後脈衝或短暫離心，收集管底部的樣品。
4. 將 20 μL 母液分裝到所需數量的 200 μL 薄壁 PCR 管中（標記/編號含有樣品的試管，包括複製品和對照品）。
   
5. 加入 5 μL DNA 模板樣本（共包含 10 ng 至 100 ng gDNA，或將 cDNA 樣本稀釋為 1:2 至 1:10），以達到 25 μL 的最終反應容量。
   
6. 旋轉 PCR 管，放入加熱蓋的熱循環器中。
   
7. 確定引物適當的 T_a 。良好的首次測試可以使用比具有最低 T_m 的引物的 T_a 低 5 °C的 T_a 。
   
8. 參考 表 P2-3.
   
9. 以 72 °C 孵育 10 分鐘來結束 PCR，以確保所有的產物都是全長的。

表 P2-3.使用抗體失活熱啟動 DNA 聚合酶的 PCR 循環條件。

溫度 (°C)熱啟動循環條件	溫度 (°C)	時間
初始熱啟動/過飽和	95	1 min
重複步驟 1-3 至 25-50 循環
Step 1	95	30秒
步驟 2	48-60	30秒
72	30 秒至 2 分鐘*
PCR 完成	PCR完成	72	10 分鐘

*注意： 延長時間取決於擴增片段的大小：500 bp 以下為 30 秒。

10. 用琼脂糖凝胶电泳分析完成反应的 10 μL 等分试样，并在透射荧光仪或其他选定的分析方法上观察。

參考資料

1. Kitchen RR, Kubista M, Tichopad A. 2010. Statistical aspects of quantitative real-time PCR experiment design. Methods. 50(4):231-236. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2010.01.025

2. Tichopad A, Kitchen R, Riedmaier I, Becker C, Sta?hlberg A, Kubista M. 2009. Design and Optimization of Reverse-Transcription Quantitative PCR Experiments. 55(10):1816-1823. https://doi.org/10.1373/clinchem.2009.126201

3. Manly B. 1998. Randomization, Bootstrap and Monte Carlo Methods. Methods in Biology. 2nd ed. Chapman Hall.

4. Francis A. 15th May, 2000. Glove me Tender. The Scientist. https://www.the-scientist.com/technology-profile/glove-me-tender-56007

5. Kellogg D, Rybalkin I, Chen S, Mukhamedova N, Vlasik T, Siebert P, Chenchik A. 1994. TaqStart Antibody:"hot start" PCR facilitated by a neutralizing monoclonal antibody directed against Taq DNA polymerase. Biotechniques. 16(6)1134-7.

6. Koukhareva I, Lebedev A. 2009. 3?-Protected 2?-Deoxynucleoside 5?-Triphosphates as a Tool for Heat-Triggered Activation of Polymerase Chain Reaction. Anal. Chem.. 81(12):4955-4962. https://doi.org/10.1021/ac8026977

7. Koukhareva I, Haoqiang H, Yee J, Shum J, Paul N, Hogrefe RI, Lebedev AV. 2008. Heat Activatable 3'-modified dNTPs: Synthesis and Application for Hot Start PCR. Nucleic Acids Symposium Series. 52(1):259-260. https://doi.org/10.1093/nass/nrn131

8. Bustin S, Nolan T. 2013. PCR Technology: Current Innovations. Third Edition. CRC Press.

9. Nolan T, Hands RE, Bustin SA. 2006. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1(3):1559-1582. https://doi.org/10.1038/nprot.2006.236