NBT 通訊協定與疑難排解

Product No.11383213001

通訊協定

與 BM 紫（或一般 NBT/BCIP）結合的可能對照：

與 BM 紫（或一般的 NBT/BCIP）結合的可能對應顏色有幾種，包括 FastGreen FCF 和 Nuclear Fast Red。

原位雜交的 NBT/BCIP 或快紅優先底物推薦：

高表達基因和進行雙標籤實驗時，可推薦使用快紅。有關使用 Fast Red 與另一種螢光底物進行 NBT/BCIP 雙重標記的資訊，請參閱：http://www-biology.ucsd.edu/~davek/intro.html

使用 NBT/BCIP 的螢光顯微鏡進行ISH 檢測：

使用 NBT/BCIP 染色的切片通常使用光學顯微鏡觀察。根據不同的對照染色，您也可以使用配備 UV 光源的顯微鏡觀察信號。非常微弱的信號也可以使用暗場照明更容易地檢測到。

請注意，NBT/ BCIP 並不是一種螢光沉澱物，就像染料 Fast Red 一樣，可以吸收並發射特殊波長的光。如果您有興趣使用螢光信號，請將 DIG / AP 與 ECF 底物系統結合，而不要使用 NBT/BCIP。

讓顏色反應過夜：

讓顏色反應過夜通常很方便。但是，這種較長的時間與探針和組織有很大關係。首先根據經驗判斷隔夜孵育是否與您的特定探針和組織相容。良好的反應後清洗也很重要。進行隔夜顯色反應時，請務必保持您的 coplin 瓶密封且置於黑暗處。NBT/BCIP 對空氣非常敏感；有氣泡存在時會形成非特異沉澱物。請經常檢查瓶中玻片之間是否有氣泡殘留，並小心清除。

使用過期的 NBT/BCIP 進行 ISH 時的影響：

當 NBT/BCIP 過了有效期時，它可能對 ISH 檢測不夠敏感。

非放射性原位雜交與Anti-DIG-AP檢測/NBT/BCIP結合的推薦對照：

眾所周知，NBT/BCIP與經典對照不相容。NBT/BCIP 信號不應與含二甲苯的裱褙介質（如 DPX）一起裱褙，因為這些介質可能會導致顏色沉澱形成晶體。

下列裱片試劑專門用於裱裝 NBT/BCIP 訊號的切片：

以下裝片試劑專門用於裝片 NBT/BCIP 訊號：Biomedia 的 Crystalmount 或 Vector Laboratories 的 Vectamount 或 Immunomount。這些公司也提供與這些裝片媒體相容的有機反襯劑（例如 Vector Methyl Green、Vector Nuclear Fast Red）。

使用典型的反冼劑(或不使用NBT/BCIP檢測)裱裝相鄰的玻片，並使用經典的含二甲苯裱裝介質裱裝玻片。

客戶推薦的裱片介質製備方案*：

甘油明膠：

• 100 mL 0.2 M 磷酸緩衝液 pH 7；
• 疊氮化鈉 200 mg；
• 明膠 15 g，攪拌至溶解；
• 甘油 100 mL。

保存在 +37 °C，滴加到玻片和蓋玻片上。

*注意：客戶推薦的方案由客戶實驗室開發，並非由羅氏驗證。羅氏對協議的內容和成功執行不承擔任何責任。在羅氏主頁上顯示客戶協議僅是羅氏為促進研究界的經驗交流而提供的一項服務。

使用石蠟包埋組織時阻止強特異信號的損失：

為達到最佳效果，請在 NBT/BCIP 檢測後對全裝胚胎進行後固定。

建議： 使用 PBS 緩衝液中的 3% 多聚甲醛，並補充 1 % 戊二醛。這應該可以防止信號在進一步的步驟中降低，例如石蠟化、切片等。在沒有固定的情況下 - 大部分顏色信號會被洗掉的步驟是乙醇洗滌系列，尤其是 70% 的乙醇洗滌步驟。使用二甲苯應該不會有問題。對於裝片，建議使用有機裝片媒體，例如M-Glas^®、Paramount、Euparal。

疑難排解

棕色-紫色而非藍色信號

對於原位雜交，NBT/BCIP 沉澱物的顏色可能會從藍色變為棕色或紫色。最終的顏色主要取決於組織中目標 mRNA 的豐度，但也受探針長度和標記強度的影響。檢測溶液的 pH 值（鹼性磷酸酶的反應緩衝液）也會產生影響，應小心調整至 pH 9.5。

一般而言，目標 RNA 的豐度越高，相對應的信號就越強，產生的藍色沉澱也就越深。如果需要更深的藍色或紫色信號，可以嘗試我們的 BM Purple 底物。

弱信號

當探針使用凝膠和/或斑點分析法進行適當的評估時，它在 Northern 杂交中應該可以很好地工作。要在 ISH 中檢測到弱信號，必須優化組織切片、整片裝片準備以及檢測程序的品質：

• 測試不同探針濃度：評估雜交混合液中探針的較高用量：例如、1, 2, 4, 8 μl 每 50 μl 杂交溶液的 50 μl 稀釋標準反應。
• 包括一個強陽性對照
• 測試使用氯仿代替蛋白酶 K、甘氨酸的替代方案。
  

測試不同的標籤方案也可能有好處。

注意：對於 DIG 原位雜交，重要的是在前處理步驟之後和雜交步驟之前，切勿使玻片乾燥。

用心臟樣本進行ISH的鹼性磷酸鹽（NBT/BCIP）檢測程序後的非特異性 「水泡狀 」藍色背景：

心臟和其他組織可能會積聚細胞內的脂滴。在冷凍切片上使用鹼性磷酸鹽 (NBT/BCIP) 檢測程序時，部分顏色沉澱物可能會被困在這些脂滴中。

使用普通鹼性磷酸酶（NBT/BCIP）檢測系統後的高泛藍背景：

使用 NBT/BCIP 造成非特異背景的原因可能是組織過度固定。這通常會導致整個組織普遍藍染。這可能無法避免，因為您使用的組織來自您無法改變的來源。

使用 NBT/BCIP 的檢測緩衝液呈深藍色，並有大量沉澱

檢查檢測緩衝液的 pH 值：必須在 pH 9.5、20 °C 的範圍內。盡量減少檢測溶液暴露於空氣中（使用密閉的 coplin 瓶）。確定濃縮 NBT/BCIP 原液中是否出現沉澱物。當顯色底物溶液中出現沉澱物時，將溶液升溫至 +50 °C，將沉澱物移除。如果沉澱物未溶解，請在使用前旋轉試管，因為這可能會造成背景；旋轉試管不會降低整體靈敏度。

防止原位雜交實驗中 DIG NBT/BCIP 信號褪色的建議：

在原位雜交後，觀察到 NBT/BCIP 的褪色並不常見。通常褪色是螢光 ISH 的問題。

切片邊緣的非特異性背景：

• 確保在檢測過程中切片不會變乾。
• 在雜交過程中，確保切片被預雜交/雜交緩衝液完全覆蓋。在這些步驟中，切片的容量減少和乾燥可能是根本原因。
  

為達到最佳效果：

• 確保用於雜交的盒子密封良好，
• 在濕潤的室內進行雜交，室內的溶液由與雜交緩衝液相同的緩衝液和甲酰胺濃度組成，
• 用蓋玻片覆蓋切片，或更方便地用保鮮膜覆蓋。