NBT/BCIP 儲存溶液協議故障排除

NBT/BCIP溶液（Product No.NBT/BCIP溶液（產品編號：11681451001）是在印圖方案中靈敏檢測鹼性磷酸酶（AP）的理想選擇，包括Southern印圖、Northern印圖、Western印圖、集落和斑塊培養、原位雜交，以及在免疫組織化學和免疫細胞化學中的應用。NBT/BCIP 可用於硝酸纖維膜和尼龍膜。

反色

• 有幾種反色可以與 BM Purple（或一般的 NBT/BCIP）結合使用，例如 FastGreen FCF 或 Nuclear Fast Red。 

裱褙介質

• NBT/BCIP與含二甲苯的裱褙介質不相容（例如、DPX）不相容，因為這些可能會導致顏色沉澱形成結晶。
• 下列裱片試劑專為 NBT/BCIP 設計：Biomedia 的 Crystalmount 或 Vector Laboratories 的 Vectamount 或 Immunomount。
• 將特定的對照顏料與任何一種裱裝介質結合的結果，主要取決於用於 NBT/BCIP 顏色檢測的組織類型。
• 使用典型的對照顏料對進行或未進行 NBT/BCIP 檢測的相鄰玻片進行染色，然後用經典的含二甲苯的裱裝介質裱裝玻片：
• 某些組織（例如， 心臟切片）可能在細胞內積聚脂滴。在冷凍切片上使用鹼性磷酸鹽（NBT/BCIP）檢測程序時，部分顏色沉澱物可能被困在這些脂滴中。在進行預雜交程序之前，先將這些切片在氯仿中脫脂（10 分鐘，RT）。

沉澱物

• 通過加熱和輕微搖動溶解湯液中的沉澱物。
• 檢測緩衝液必須接近 pH 9.5，（在 20 °C 下）並盡量減少檢測溶液暴露於空氣中（密閉的 coplin 瓶）。

高一般藍色背景

• 使用 NBT/BCIP 的高一般非特異背景可能是由於組織的過度固定。這通常會導致整個組織普遍藍染。此背景不會干擾特異性信號。

褐紫色代替藍色信號

• 使用 NBT/BCIP 會產生藍色信號。
  • 原位雜交時，NBT/BCIP沉澱物的顏色可以從藍色變為棕色或紫色。最終顏色主要取決於組織中目標 mRNA 的豐度，但也受探針長度和標記強度的影響。檢測溶液的 pH 值（鹼性磷酸酶的反應緩衝液）也會產生影響，應小心調整至 pH 9.5。
  • 一般而言，目標 RNA 的豐度越高，相對應的信號就越強，因此沉澱物的藍色就越深。
  • 使用 BM Purple 底物可看到深藍色或紫色信號。
  • 玻片從邊緣乾燥可能會造成非特異性背景。