Section Overview
如何計算 DNA 的 Tm？
寡核苷酸的熔解溫度 (Tm) 是指 50％ 的寡核苷酸與其完美互補體雙重時的溫度，以及 50％ 的寡核苷酸在溶液中游离時的溫度。認識 Tm 對於分子生物學中的許多技術 (例如 PCR、Southern 印跡、原位雜交) 極為重要。其中一些經典技術仍與較新的技術一起廣泛使用，例如基於 PCR 的樣本文庫製備，以用於下一代測序。
確定 Tm 最常見的實驗方法是量測寡核苷酸與其補充物的吸光度變化與溫度的關係 (圖 1)。雖然由實驗決定的 Tm 值是最精確的，但在使用經典分子技術進行例行應用時，這些值並不是必需的。
圖 1.實驗測定寡核苷酸 Tm 的範例。 測量是在 UV-Vis 分光光度計的恆溫池中進行。Tm 是介於雙鏈 DNA (dsDNA) 和單鏈 DNA (ssDNA) 平臺中間的讀數。
其中：
Tm = 熔化溫度，單位 °C
ΔH ；= 焓變化，單位 kcal mol-1 （計算退火/熔化過程中的能量變化）
A = 常數 -0.0108 kcal K-1 ᐧ mol-1 (account for helix initiation during annealing / melting)
ΔS =熵變，單位為 kcal K-1 ᐧmol-1 (表示能量無法做功，即無序) (表示能量無法做功，即無序)。e. 紊亂)
R =氣體常數0.00199 kcal K-1 ᐧmol-1 （使能量與溫度成比例的常數）
= 氣體常數 0.i>
C =寡核苷酸濃度，單位 M 或 mol L-1 （我們使用 0.0000005，即 0.5 µM）
-273.15 = 將預期溫度 (Kelvins) 改為 °C 的轉換因子
[Na+] = 鈉離子濃度 (M 或 mol L-1 (我們使用 0.05，即。50 mM）
ΔH、 ΔS 的最近鄰值數目有限。和 A的最近鄰值是有限的，這些值 可以直接插入上述公式（表 1）。
表 1. ΔH 和 ΔS的最近鄰值。 在作為基本近鄰公式來源的論文（參考 1）中，ΔS, A和 的報告單位是 cal K-1 ᐧ mol-1，因此在公式中要乘以 1,000 系數來平衡單位ΔH （報告單位是 kcal mol-1）。在此，我們以 kcal K-1 ᐧ 為單位報告 ΔS、 A 和 R 。mol-1 ，使每個參數的單位相匹配，從而使下面的示例計算在進行維度分析時更加直觀。無論採用哪種方法，計算出的 Tm 都是相同的。如需完整的 ΔH 和 ΔS 值清單，包括擺動序列，請聯絡我們的技術服務團隊 [email protected].
.DNA | RNA | |||
|---|---|---|---|---|
| Interaction | ΔH | ΔS | ΔH | ΔS |
| AA/TT* | 9.1** | -0.0240 | -6.6 | -0.0184 |
| AT/TA | -8.6 | -0.0239 | -5.7 | -0.0155 |
| TA/AT | -6.0 | -0.0169 | -8.1 | -0.0226 |
| CA/GT | -5.8 | -0.0129 | -10.5 | -0.0278 |
| GT/CA | -6.5 | -0.0173 | -10.2 | -0.0262 |
| CT/GA | -7.8 | -0.0208 | -7.6 | -0.0192 |
| GA/CT | -5.6 | -0.0135 | -13.3 | -0.0355 |
| CG/GC | -11.9 | -0.0278 | -8.0 | -0.0194 |
| GC/CG | -11.1 | -0.0267 | -14.2 | -0.0349 |
| GG/CC | -11.0 | -0.0266 | -12.2 | -0.0297 |
* 左側序列是 5「 到 3」，而右側序列是 3「 到 5」，例如 AA/TT，AA 是 5「 到 3」，TT 是 3「 到 5」。在選擇值時，無論是左側序列還是右側序列的正確取向，總要從 5「 到 3」 方向選擇。
***負值反映退火在焓和熵上是有利的。正值反映了相反的反應，即熔化，並會導致相同的 Tm 計算。 This example will demonstrate the manual calculation of the Tm for the following sequence:
5'-AAAAACCCCCGGGGTTTTT-3'
這是上述序列與它的反向互補配對：
5'-AAAAACCCCCGGGGTTTTT-3'
3'-TTTTTGGGGCCCCCAAAAA-5'
第一步：找出 ΔH 和 ΔS 的最近鄰值，並求和每個參數
讀取目標序列 5「 到 3」，所有最近鄰的ΔH 和 ΔS 值可在表 1 中找到。已識別的最近鄰居對及其 ΔH 和 ΔS 值（以及總和）如下：
| Nearest Neighbors | ΔH | ΔS | |
|---|---|---|---|
| AA/TT | -9.1 | -0.0240 | |
| AA/TT | -9.1 | -0.0240 | |
| AA/TT | -9.1 | -0.0240 | |
| AA/TT | -9.1 | -0.0240 | |
| GT/CA | -6.5 | -0.0173 | |
| GG/CC | -11.0 | -0.0266 | |
| GG/CC | -11.0 | -0.0266 | |
| GG/CC | -11.0 | -0.0266 | |
| GG/CC | -11.0 | -0.0266 | |
| CG/GC | -11.9 | -0.0278 | |
| GG/CC | -11.0 | -0.0266 | |
| GG/CC | -11.0 | -0.0266 | |
| GG/CC | -11.0 | -0.0266 | |
| GG/CC | -11.0 | -0.0266 | |
| GT/CA | -6.5 | -0.0173 | |
| AA/TT | -9.1 | -0.0240 | |
| AA/TT | -9.1 | -0.0240 | |
| AA/TT | -9.1 | -0.0240 | |
| AA/TT | -9.1 | -0.0240 | |
| -0.和 | -185.7 | -0.4672 |
步驟二：將值插入近鄰公式，計算熔解溫度
Tm = 69.6 ℃
作為比較，以下是線上寡核苷酸序列計算機確定的值：
Tm = 69.
手動計算出的值為 69.6，而線上計算器計算出的值為 69.7（出現差異的原因是，在本範例計算中，氣體常數的原始文獻值 1.987 被四捨五入為 1.99）。
該值 69.7 將顯示在隨此寡核苷酸提供的技術資料表上。
我們使用的次要方法是計算 Tm is the basic method (a modified Marmur Doty formula3), which we use for oligonucleotides with short sequences lengths, i. e. those are 14 bases or more than 14 bases.即 14 個碱基或更少的寡核苷酸。此方法部分源自膜雜交實驗，假設引物濃度為 50 nM、單價 (Na+) 離子濃度為 50 mM、pH 值為 7.0。鑑於膜雜交實驗現在不像幾十年前最初進行這項研究時那麼普遍，因此修正因子會考慮到寡核苷酸可能在溶液中是游離的，例如用於更現代的技術，例如 PCR。
我們使用以下修正的 Marmur Doty 公式：
Tm = 2(A + T) + 4(C + G) - 7
其中：
Tm = 熔化溫度，單位 °C
A ；= 序列中腺苷酸核苷酸的數量
T =序列中胸苷酸核苷酸的數量
= 序列中胞嘧啶核苷酸的數目
G = 序列中鸟苷酸核苷酸的數目
-7 =溶液中的校正因子
Marmur Doty 例程計算。 This example will demonstrate the manual calculation of the Tm for the following sequence:
5'-ACGTCCGGACTT-3'
Step one：將值插入 Marmur Doty 公式計算熔化溫度
Tm = 2(A + T) +4(C )+ G) - 7
Tm = ；2(2 + 3) + 4(4 + 3) - 7
Tm = 31.0 ℃
作為比較，以下是線上寡核苷酸序列計算機確定的數值：
31.0 的值會顯示在隨此寡核苷酸提供的技術資料表上。
如果您打算使用此類短寡核苷酸進行膜雜交實驗，我們鼓勵您在顯示的 Tm 上手動加上 +7 (即：上述值應為 38 °C)、上述值應為 38 °C）。
用兩種方法中的一種來確定寡核苷酸的Tm ，它是針對經典分子技術而優化的。如果需要其他協助，請洽詢我們的技術服務團隊 ，網址是 [email protected]...
參考資料
若要繼續閱讀，請登入或建立帳戶。
還沒有帳戶？為便利客戶閱讀，此頁面中文以機器翻譯完成。雖然我們已盡力確保機器翻譯的準確性，但機器翻譯並非完美。如果您對機器翻譯的內容不滿意，請參考英文版本。
