植物/真菌 DNA 分離試劑盒協議

Product No. E5038

Norgen的植物/真菌DNA分離試劑盒提供了從多種植物和真菌中分離和純化總DNA的快速方法。此外，該試劑盒還提供了檢測可能感染植物的病原體的便捷方法，因為它可以在純化總 DNA 的同時純化任何病原體 DNA。使用本試劑盒可從新鮮或冷凍的植物組織、植物細胞或真菌樣本中純化總 DNA。DNA 可優先從蛋白質等其他細胞成分中純化出來，無需使用苯酚或氯仿。純化後的 DNA 具有最高的完整性，可用於多種下游應用，包括實時 PCR、Southern 印跡、SNP 分析和測序。

Norgen 的純化技術

純化技術基於旋轉柱層析。DNA 可優先從蛋白質等其他細胞成分中純化出來，而無需使用苯酚或氯仿。此過程須在研缽中以液氮（或其他均質設備）研磨植物組織。接著加入 Lysis Solution 和 RNase A，然後在 65 °C 下短暫孵育。接著，再將結合溶液加入裂解液中，然後再次在冰上短暫孵育。然後將裂解液通過提供的過濾柱旋轉，以去除任何碎屑。然後將乙醇加入澄清的裂解液中，並將溶液載入旋轉柱中。Norgen 樹脂結合核酸的方式取決於離子濃度，因此只有 DNA 會結合到柱子上，而大部分的 RNA 和蛋白質則會在流動過程中被移除。結合的 DNA 接著會用所提供的洗滌液 I 和 II 洗滌，以去除任何剩餘的雜質，而純化的總 DNA 則會用洗滌緩衝液洗脫。純化後的 DNA 具有最高的完整性，可用於許多下游應用。

規格

套件規格
最大色譜柱結合容量	50 µg
	最大色譜柱載入量	650 µL
Maximum Amount of Starting Material： 植物組織 真菌（濕重）	100 mg 100 mg
平均產量* 50 mg 番茄葉 50 mg 葡萄葉 50 mg 桃葉 50 mg 李葉 50 mg 松針 100 mg 覆盆子葉 100 mg 草莓葉 Botrytis cinerea (50 mg wet weight) Fusarium sp. (50 毫克濕重) 黑曲黴菌(50 毫克濕重)	18 µgg 10 µg 10 µg 10 µg 5 µg 5 µg 2.5 µg 1.5 µg 2 µg 4 µg
完成 10 次純化所需時間	45分鐘

*  平均產量會因種類、生長條件和發育階段等多項因素而異.

套件元件

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Component	目錄編號。E5038 (50個製備品)
溶劑	30 mL
裂解液	30 mL
結合液	7 mL
洗滌液 I<	18毫升
洗滌液 II	30 毫升
洗滌緩衝液	9 mL
RNase A	1小瓶
篩選柱
旋轉柱	50
收集管	100支
洗脱管 (1.7 mL)	50
產品目錄	1

優點

• 使用快速旋轉柱格式進行快速簡便的處理
• 可適應目前的細胞均質化方法
• 無需酚或氯仿提取
• 可從多種植物和真菌物種（包括任何病原體DNA）中分離出高品質的總DNA
• 總 DNA 產量高

儲存條件與產品穩定性

除 RNAse 應儲存於 -20 °C 外，所有溶液均應密封並儲存於室溫。

注意事項和免責聲明

本試劑盒僅為研究目的而設計。不擬用於人體或診斷用途。使用化學品時，確保穿著適當的實驗室外套、戴上一次性手套和防護眼罩。如需詳細資訊，請參閱適當的材料安全資料表 (MSDS)。這些材料安全資料表可以 PDF 格式在線上提供，網址為 www.norgenbiotek.com.

清洗液 I 含有胍鹽，應小心處理。胍鹽與漂白劑結合後會形成高活性化合物，因此必須小心妥善處理任何這些溶液。

客戶提供的試劑和設備

您必須具備下列條件，才能使用植物/真菌 DNA 分離試劑盒：

• 台式微離心機
• 65 °C 培養箱
• 冰浴96-100%乙醇
• 70%乙醇v
• 液氮或任何機械均質器

程序

所有離心步驟均在台式微離心機中進行。不同的步驟需要不同的速度，因此請檢查您的微離心機規格，以確保它能夠達到適當的速度。所有離心步驟均在室溫下進行。正確的轉速可使用下列公式計算：

其中 RCF = 所需的重力加速度（以 g 為單位的相對離心力）； r ；= 以 cm 為單位的轉子半徑；及 RPM = 達到必要的 g力所需的每分鐘轉數。

使用前注意事項

• 除特別註明外，所有離心步驟均在台式微離心機中以 10,000 x g (~ 10,000 RPM)  進行。所有離心步驟均在室溫下進行。
• 應使用變速離心機以獲得最大的試劑盒性能。如果沒有變速離心機，可使用定速離心機，但產率可能會降低。
• 使用前確保所有溶液處於室溫。如有必要，加熱至 65 °C，以重新溶解沉澱物。
• 製備工作濃度的 洗滌溶液 I ，將 24 mL 96 -100%乙醇（由用戶提供）加入到提供的裝有濃縮 洗滌溶液 I的瓶中。最終容量為 42 mL。
• 製備工作濃度的 洗滌溶液 II ，將 70 mL 96 - 100 % 的乙醇（由使用者提供）加到提供的裝有濃縮 洗滌溶液 II 的瓶中。最終的容量為 100 mL。瓶子上的標籤有一個方塊，可以勾選以表示乙醇已經加入。
• 將 RNase A 溶液在 4 °C 下儲存最多 3 個月。若要儲存更長時間，應將 RNase A 溶液分成小份等分，並儲存於 -20 °C。
• 本程序建議使用不超過 100 mg 的真菌（濕重）或 100 mg 的植物組織，以防止柱子堵塞。但是，在某些情況下，根據植物的 DNA 含量，可以將處理的植物材料數量增加到 150 mg。
• 本套件提供 2 支獨立的色譜柱。將柱從標籤袋中取出時，可輕鬆識別如下：
  • 過濾柱 -包含一個透明的塑膠 O 型環
  • 旋轉柱 -包含一個灰色的塑膠 O 型環

1. 裂解物製備
   1. 將 ≤100 mg 的植物組織或濕真菌放入含有液氮的研缽中，研磨成粉末。將植物或真菌粉末移至不含 DNase 的 1.7 mL 微離心管（未提供）中，加入 500 µL 的 裂解液 和 1 µL 的 RNase A。
      另外，本程序也可使用其他均質方法，包括珠子系統。如果使用其他方法，在均質化後立即向樣本中加入 500 µL 的裂解液 和 1 µL 的RNase A ，渦旋 20 秒以混合。
   2. 在 65 ºC 孵育 10 分鐘。
   3. 加入 100 µL 的結合溶液，徹底混和，在冰上孵育 5 分鐘。
   4. 將一個過濾柱（透明 O 環）與提供的一個收集管組裝。
   5. 用移液管僅將流過的透明上清液轉移到不含 DNase 的微離心管（未提供）中。
   6. 在上述收集的裂解液中加入等量的 70% 乙醇（由用戶提供）（每 100 µL 裂解液加入 100 µL 乙醇）。渦旋混合。 進行步驟 2。
2. 結合至柱
   1. 將旋轉柱（灰色 O 形環）與提供的其中一個收集管組合。
   2. 將最多 650 µL 含有乙醇的澄清裂解液加到 Spin Column 上，然後以 10,000 × g (~10,000 RPM) 離心 1 分鐘。
      注意：通過檢查柱子，確保整個裂解液體積已通過到收集管中。
   3. 視您的裂解液量而定，必要時重複步驟 2.2。
3. 柱洗
   1. 向柱中加入 500 µL 的 洗液 I 并离心 1 分钟。
   2. 丟棄流出液，將旋轉柱與收集管重新裝配。
   3. 向柱中加入 500 µL 洗液 II  並離心 1 分鐘。
   4. 重複步驟 3.3 和 3.4。
   5. 在 14,000 x g (~14,000 RPM) 下旋轉柱 2 分鐘，徹底乾燥樹脂。
4. DNA 洗脱
   1. 將柱置入套件提供的新的 1.7 mL 洗脱管中。
   2. 向柱中加入 100 µL 的洗脱缓冲液 ，室温下孵育 1 分钟。
   3. 以 10,000 x g (~10,000 RPM)離心1分鐘。注意從柱中洗出的體積。如果未洗出全部容量，則以 14,000 x g (~14,000 RPM)  的速度再旋轉 1 分鐘：如果需要，可以重複步驟 4.2 和 4.3 ，在不同的洗滌管中使用 50 µL 洗滌緩衝液，進行額外的洗滌。進行第二次洗脫時，總產率可再提高 20-30%。
5. DNA 的儲存
   純化的基因組 DNA 可在 2-8 °C 儲存數天。若要長期保存，建議在 -20 °C 下保存。

疑難排解指南

Problem	Possible Cause	Solution and Explanation
DNA回收率低	色譜柱阻塞	請勿超過起始材料的建議用量。如果色譜柱顯示堵塞低於建議用量，可能需要減少起始材料的用量。另請參閱下面的 「柱子堵塞」。
	使用了另一種洗滌緩衝液	建議使用本試劑盒提供的洗滌緩衝液，以獲得最大的DNA回收率。
	未在裂解液中加入70%乙醇	確保在與色譜柱結合前，在裂解液中加入等量的70%乙醇。
	乙醇未加入到洗滌液中	確保在使用前，在提供的洗滌液 I 和 II 中加入指定量的 96 - 100%乙醇。
柱子堵塞	最大組織量超出試劑盒規格	最佳輸入量為 100 mg 植物組織或真菌（濕重）。但是，對於某些物種，根據樣本的 DNA 含量，最多可處理 150 mg 的組織。
	裂解液上清液中有太多的細胞碎片	在步驟 1.之後，將裂解液以 14,000 x g (~14,000 RPM)  離心 5 分鐘。3 並使用乾淨的上清液進行步驟 1.4。
	離心機溫度過低	確保離心機在整個程序中保持在室溫。溫度低於 20 °C 可能會形成沉澱物，導致離心柱堵塞。
DNA在下游應用中表現不佳	需要優化PCR反應條件
	未在裂解液中加入結合溶液	確保在裂解液中加入結合溶液，並在旋轉裂解液前在冰上孵育 5 分鐘
	DNA 未用提供的洗滌液 II 洗滌	如果柱子未用洗滌液 II 洗滌兩次，結合步驟產生的微量鹽可能殘留在樣品中。
	乙醇攜帶	確保在洗柱程序下進行乾旋，以便在洗脫之前去除微量乙醇。已知乙醇會干擾許多下游應用。