人類真皮纖維母細胞 (HDF) 培養規範

培養前的準備
Subculturing HDF
材料

 

I。儲存

A.低溫保存的小瓶 (106-05a, 106-05f, 106-05n)

低溫保存的小瓶一經運抵，請立即存放於液氮儲存槽中。

*從液氮儲存槽中取出低溫保存的小瓶時，請務必戴上面罩和手套。

*從液氮儲存槽中取出低溫瓶時，請務必戴上面罩和手套，因為從儲存槽到室內的溫度變化極大，可能會導致低溫瓶中殘留的液氮爆裂並造成傷害。

圖 1. 人類真皮纖維母細胞 (HDF)

II。培養前的準備工作

1. 確保具有 HEPA 過濾層流空氣的 Class II 生物安全櫃處於正常工作狀態。
2. 確保所有血清移液器、移液器吸頭及試劑溶液均為無菌。
3. 遵循標準的消毒技術和安全規則：
   a. 不要用嘴移液。請勿用口移液。
   b．使用人類細胞時，即使所有菌株均已
       經過 HIV、乙型肝炎和丙型肝炎測試呈陰性反應，也一定要戴手套和安全眼鏡。在無菌罩中處理所有細胞培養工作。

III.培養 HDF

A.準備培養 HDF 的細胞培養瓶

1. 從冰箱中取出 成纖維細胞生長培養基 (116-500)。
2. 用移液管移取 15 ml 的 成纤维细胞生长培养基 (116-500)*到一个 T-75 烧瓶 (SIAL0641)中。
   * 保持培养基与表面积的比例为每 5 cm² 1ml。
   例如：
   -  5 ml 用於 T-25 燒瓶 (SIAL0639) 或 60 mm 組織培養皿 (SIAL0166)。
   -  15 ml for a T-75 flask (SIAL0641) or a 100 mm tissue culture dish (SIAL0167).

B。解凍和電鍍 HDF

1. 使用適當的眼睛和手部保護措施，從液氮儲存槽中取出冷凍保存的 HDF 小瓶。
2. 將小瓶蓋轉動四分之一圈，以釋放可能殘留在螺紋中的液氮，然後再重新鎖緊瓶蓋。
3. 將小瓶的下半部放入 37 °C 水浴中快速解凍細胞，並在解凍過程中密切觀察小瓶。
4. 在無菌生物安全櫃中用 70% 酒精去除小瓶外部的污染。請勿用手觸摸瓶蓋邊緣或小瓶，以避免污染。
5. 用 2 ml 移液管輕輕地移動細胞 5 次，重悬小瓶中的細胞。
6. 將小瓶中的細胞懸浮液（1 ml）移入盛有 15 ml 成纖維細胞生長培養基（116-500）的 T-75 燒瓶（SIAL0641）中。
7. 蓋上瓶蓋，輕輕搖動，使細胞均勻分佈。
8. 将T-75烧瓶(SIAL0641)置于37 ^oC，5% CO₂ 加湿培养箱中。鬆開瓶蓋以進行氣體交換。
9. 24小時後或隔夜換上新鮮的 成纖維生長培養基 (116-500)，以去除所有DMSO的痕跡。
10. 隔天換一次 成纖維生長培養基 [116-500]，直到細胞達到60%的融合度。
11. 當培養達到 60% 匯合或週末飼養時，加倍 成纖維母細胞生長培養基 [116-500]的用量。
12. 當 HDF 培養達到 80% 匯合時，進行細胞分離培養。

IV.亞培養 HDF

A.準備亞培養試劑

1. 從-20 °C的冷凍庫中取出 胰蛋白酶-EDTA溶液 (T3924)和 胰蛋白酶抑制劑 (T6414)，並在冰箱中解凍過夜。
2. 確保所有亞培養試劑均已解凍。輕輕攪拌每瓶試劑數次，以形成均勻的溶液。
3. 將所有亞培養試劑儲存於 4 °C，以備日後使用。
4. 如果只需要一部分 胰蛋白酶/EDTA溶液 (T3924)，請將未使用的部分儲存於-20 °C。

B.準備培養瓶

1. 從冰箱中取出 成纖維母細胞生長培養基 (116-500)。
2. 用移液管移取 30 ml 成纖維母細胞生長培養基 (116-500)至 T-175 燒瓶 (SIAL1080)（將用於第四節 C 步驟 15。

C. Subculturing HDF

Trypsinize Cells at Room Temperature.

1. 吸出培養瓶中的培養基。
2. 用 HBSS (H6648)清洗單層細胞，吸出溶液。
3. 用移液管移取 6 ml 的 胰蛋白酶/EDTA 溶液 (T3924) 到 T-75 燒瓶 (SIAL0641)中。
4. 立即移除 5 ml 溶液。
5. 重新蓋緊瓶蓋，在室溫下於倒置顯微鏡下觀察胰蛋白酶化的進度。
6. 用手掌撞擊瓶子的側面，直到大部分細胞脫離，從培養表面釋放圓形細胞。
7. 用移液管移取 5 毫升胰蛋白酶抑制劑溶液(T6414)到瓶中，以抑制進一步的胰蛋白酶活性。
8. 將培養瓶中的細胞懸浮液轉移到 50 ml 無菌錐形管中。
9. 用另外 5 ml 的 胰蛋白酶抑制溶液 (T6414)冲洗烧瓶，并将溶液转移到同一锥形管中。
10. 在显微镜下检查 T-75 烧瓶 (SIAL0641)。
11. 將錐形管以 220 x g 離心 5 分鐘，使細胞沉澱。
12. 噴出管中的上清液，不要打亂細胞沉澱。
13. 用手指輕彈圓錐管的頂端，鬆開細胞團。
14. 將細胞重懸在 5 ml 的成纖維細胞生長培養基（116-500）中，用移液器輕輕地移動細胞，使其團塊破裂。
15. 用血球計或細胞計數器計數細胞。接種 6,000 cells per cm² 進行快速生長，或接種 3,000 cells per cm² 進行定期分離培養。

材料

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