牛主動脈內皮細胞 (BAOEC) 培養方案

I.儲存

A.低溫保存小瓶 (B304-05)

低溫保存小瓶運抵後立即存放在液氮儲存槽中。

*從液氮儲存槽中取出冷凍樣本時，請務必戴上面罩和手套。從儲存槽到室內的劇烈溫度變化可能導致冷凍瓶中滯留的液氮爆裂並造成傷害。

牛主動脈內皮細胞 (BAOEC)

II.培養前的準備

1. 確保具有 HEPA 過濾層流空氣的二級生物安全櫃處於正常工作狀態。
2. 用 70% 酒精消毒生物安全櫃。
3. 開始細胞培養工作前，將生物安全櫃的鼓風機打開 10 分鐘。
4. 確保所有血清移液器、移液器吸頭和試劑溶液均為無菌。
5. 遵循標準的消毒技術和安全規則：
   a. 不要用嘴移液。請勿用口移液。
   b．即使所有動物
      都已通過美國農業部的檢查，在處理動物細胞時也一定要戴手套和安全眼鏡。

III.培養 BAOEC

A.準備培養 BAOEC 的細胞培養瓶

1. 從冰箱中取出 Bovine Endothelial Growth Medium (B211-500)。
2. 用移液管移取 15 ml 牛內皮生長培養基 (B211-500) 。SIAL0641）。
   * 保持培養基與表面面積比率為每 5 cm² 1ml。
   例如：
   -  5 ml 用於 T-25 燒瓶 (SIAL0639)。)或 60 mm 組織培養皿 (SIAL0166)。
   -  15 ml 用於 T-75 燒瓶 (SIAL0641< /a>)。/a>）或 100 mm 組織培養皿 (SIAL0167)。

B.解凍和電鍍 BAOEC

1. 使用適當的眼睛和手部保護措施，從液氮儲存槽中取出低溫保存的 BAOEC 小瓶。
2. 將小瓶蓋轉動四分之一圈，以釋放可能滯留在螺紋中的液氮，然後將蓋子重新鎖緊。
3. 將小瓶的下半部放入 37 °C 水浴中快速解凍細胞，並在解凍過程中密切觀察小瓶。
4. 當小瓶中只剩下少量冰時，從水浴中取出小瓶。不要讓細胞完全解凍。請勿用手觸摸瓶蓋邊緣或小瓶，以避免污染。
5. 用 2 ml 移液管輕輕地移動細胞 5 次，重悬小瓶中的細胞。注意不要太用力，以免起泡。
6. 用移液管將小瓶中的細胞懸浮液（1ml）移入 T-75 燒瓶（SIAL0641）中。B211-500）。
7. 蓋上瓶蓋，輕輕搖動，使細胞均勻分佈。
8. 將 T-75 燒瓶（SIAL0641)放入 37 ^oC、5% CO₂ 加濕培養箱中。鬆開瓶蓋以進行氣體交換。
9. 24小時後或隔夜換上新鮮的Bovine Endothelial Growth Medium (B211-500)，以去除所有DMSO的痕跡。
10. 隔天更換 Bovine Endothelial Growth Medium (B211-500)，直到細胞達到 60% 匯合。
11. 當培養達到 >60% 匯合或週末餵養時，加倍 Bovine Endothelial Growth Medium (B211-500)的用量。
12. 當 BAOEC 培養達到 80% 匯流時，對細胞進行分培。

IV.亞培養 BAOEC

A.準備亞培養試劑

1. 移除 胰蛋白酶-EDTA溶液 (T3924<T6414)從 -20 °C 的冷凍庫中取出，並在冰箱中解凍過夜。
2. 確保所有亞培養試劑都已解凍。輕輕攪拌每瓶試劑數次，以形成均勻的溶液。
3. 將所有亞培養試劑儲存於 4 °C，以備日後使用。
4. 胰蛋白酶/EDTA溶液(T3924)。如果只需要一部分 胰蛋白酶/EDTA (T3924) ，請將未使用的部分儲存於 -20 °C。

B.準備培養瓶

1. 從冰箱中取出牛內皮生長培養基 (B211-500)。在無菌罩中用 70% 酒精消毒瓶子。
2. 移取 35 ml 牛內皮生長培養基((SIAL1080)中。）(to be used in Section IV C Step 15.)

C.在室溫下胰蛋白酶化細胞。

1. 吸出培養瓶中的培養基。
2. 用 HBSS (H6648)清洗單層細胞，吸出溶液。
3. 用移液管移取 6 ml 的 胰蛋白酶/EDTA 溶液 ( T3924)。SIAL0641）中。
4. 立即移除 5.5 ml 溶液。
5. 重新蓋緊瓶蓋，在室溫下倒置顯微鏡下監測胰蛋白酶化的進度。
6. 用手掌撞擊瓶子的側面，直到大部分細胞脫落，從培養面釋放出圓形細胞。
7. 用移液管吸取 8 ml 的胰蛋白酶抑制劑溶液（T6414）到燒瓶中，以抑制進一步的胰蛋白酶活性。
8. 將培養瓶中的細胞懸液移至 50 ml 無菌錐形管中。
9. 用另外 5 ml 的胰蛋白酶抑制劑溶液沖洗燒瓶（T6414），並將溶液移入同一個錐形管中。
10. 在顯微鏡下檢查 T-75 燒瓶 (SIAL0641)。
11. 將錐形管以 220 x g 離心 5 分鐘，使細胞沉澱。
12. 將上清液從管中抽出，不要打亂細胞沉澱。
13. 將細胞重悬於 5 ml 牛內皮生長培養基(B211-500)中，用移液器輕輕地移動細胞，使其團塊破碎。
14. 使用血球計或細胞計數器計數細胞。以每 cm² 4,000 cells 的接種量進行定期的次培養。

材料

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