HCF 培養協議

在正常心臟中，人類心臟成纖維細胞（HCF）在細胞外基質維持、生長因子合成和細胞因子合成中扮演關鍵角色。本方案概述了人類心臟成纖維細胞的培養和亞培養的推薦程序。

部分概述

• 儲存
• 培養物準備
培養 HCF
• 亞培養 HCF
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I.儲存

低溫保存瓶

低溫保存瓶 (306-05f) 一經運抵，請立即儲存於液氮儲存槽*中。

*從液氮儲存槽中取出低溫保存瓶時，請務必戴上面罩和手套。從儲存槽到室內的劇烈溫度變化可能導致冷凍瓶中滯留的液氮爆裂並造成傷害。

人類心臟成纖維細胞 (HCF)

II.培養準備

1. 確保具有 HEPA 過濾層流氣流的 II 級生物安全櫃處於正常工作狀態。
2. 使用 70% 酒精對生物安全櫃進行消毒。
3. 在開始細胞培養工作之前，將生物安全櫃的鼓風機打開 10 分鐘。
4. 確保所有血清移液器、移液器吸頭和試劑溶液均為無菌。
5. 遵循標準的消毒技術和安全規則：

• 請勿用口移液。
• 即使所有菌株的 HIV、乙型肝炎和丙型肝炎檢測結果均為陰性，但在處理人類細胞時，請務必戴上手套和安全眼鏡。
• 在無菌罩中處理所有細胞培養工作。

III.培養 HCF

A.準備培養 HCF 的細胞培養瓶

1. 從冰箱中取出 心纖維母細胞生長培養基 (316-500)。
2. 用移液管吸取 15 mL 的 心成纖維母細胞生長培養基 (316-500)* 到一個 T-75 燒瓶 (SIAL0641)中。

*保持培養基與表面面積的比例為每 5 cm² 1 mL。例如：

• 5 mL 用於 T-25 燒瓶  (SIAL0639) 或 60 mm 組織培養皿  (SIAL0166)。
• 15 mL 用於 T-75 燒瓶(SIAL0641)或 100 mm 組織培養皿(SIAL0167).

B.解凍和平板 HCF

1. 使用適當的眼睛和手部保護措施，從液氮儲存槽中取出低溫保存的小瓶 HCF。
2. 將小瓶蓋轉動四分之一圈，以釋放可能困在螺紋中的液氮，然後再重新鎖緊瓶蓋。
3. 將小瓶的下半部放入 37 °C 水浴中快速解凍細胞，並在解凍過程中密切觀察小瓶。
4. 當小瓶中只剩下少量冰時，從水浴中取出小瓶。不要讓細胞完全解凍。
5. 用 2 mL 移液管輕輕地移動細胞 5 次，重悬小瓶中的細胞。注意不要太用力，以免起泡。
6. 用移液管將小瓶中的細胞懸浮液（1 mL）移入盛有 15 mL 心臟成纖維細胞生長培養基的 T-75 燒瓶（SIAL0641）中。
7. 蓋上瓶蓋，輕輕搖動，使細胞均勻分佈。
8. 將 T-75 燒瓶放入 37^oC、5% CO₂ 加濕培養箱中。鬆開瓶蓋以進行氣體交換。
9. 24小時後或隔夜換上新鮮的 心成纖維母細胞生長培養基 (316-500)以去除所有DMSO的痕跡。
10. 每隔一天更換一次 心纖維母細胞生長培養基 (316-500)，直到細胞達到 60% 融合度。
11. 當培養達到 >60% 匯合或週末餵養時，加倍 心纖維母細胞生長培養基 (316-500) 的容量。
12. 當 HCF 培養達到 80% 匯合時，對細胞進行分培。

IV.亞培養 HCF

A.準備亞培養試劑

1. 從 -20 °C 冷凍庫中取出 胰蛋白酶-EDTA 溶液 (T3924) 和 胰蛋白酶抑制劑 (T6414) 並在冰箱中解凍過夜。
2. 確保所有亞培養試劑均已解凍。輕輕攪拌每瓶試劑數次，以形成均勻的溶液。
3. 將所有亞培養試劑儲存於 4 °C，以備日後使用。
4. 如果只需要一部分 胰蛋白酶/EDTA溶液 (T3924)，請將未使用的部分儲存於-20 °C。準備培養瓶
   1. 從冰箱中取出 心纖維母細胞生長培養基 (316-500)。在無菌罩中用 70% 酒精消毒瓶子。
   2. 用移液管移取 30 mL 的 心成纖維細胞生長培養基 (316-500)到一個 T-175 燒瓶 (SIAL1080)（將用於第四節 C 步驟 15。)

   C.

   Trypsinize cells at Room Temperature.

   1. 吸出培養瓶中的培養基。
   2. 用 HBSS (H6648)清洗單層細胞，吸出溶液。
   3. 用移液管吸取 6 mL 胰酶/EDTA 溶液(T3924)到 T-75 烧瓶(SIAL0641)中。
   4. 立即移除 5 mL 溶液。
   5. 重新蓋緊瓶蓋，在室溫下於倒置顯微鏡下觀察胰蛋白酶化的進度。
   6. 用手掌拍打瓶側，直到大部分細胞脫落，從培養液表面釋放渾圓的細胞。
   7. 用移液管移取 5 mL 胰蛋白酶抑制劑溶液(T6414)到瓶中，以抑制進一步的胰蛋白酶活性。
   8. 將培養瓶中的細胞懸浮液轉移到 50 mL 無菌錐形管中。
   9. 用另外 5 mL 的 胰蛋白酶抑制溶液 (T6414)冲洗烧瓶，并将溶液转移到同一锥形管中。
   10. 在显微镜下检查 T-75 烧瓶 (SIAL0641)。
   11. 將圓錐管以 220 x g 離心 5 分鐘，使細胞沉澱。
   12. 噴出管中的上清液，不要打亂細胞沉澱。
   13. 將細胞重懸於 5 mL 的心臟成纖維細胞生長培養基(316-500)中，用移液器輕輕地移動細胞，使其團塊破碎。
   14. 使用血球計或細胞計數器計數細胞。快速生長時接種 10,000 cells per cm² ，定期分次培養時接種 7,000 cells per cm² 。