酵母轉化協議

Introduction

酵母被認為是真核生物研究的模型系統，因為它們具有快速生長和細胞分散的特性。此外，酵母細胞的複製培養和突變體分離可以相對容易地完成，而且它們有一個明確的遺傳系統。最重要的是，酵母具有高度通用的 DNA 轉換系統，可有效地用於蛋白質生產。

異獸變身

表一Sigma-Aldrich 酵母轉換產品

說明	應用	功能/優點
YEAST1	Yeast Transformation Kit 本產品包含： 10 μg 控制酵母質粒 DNA，pRS316 100 mL PLATE 緩衝液 100 mL 轉換緩衝液	適合轉換任何品種的酵母。方便、靈活、靈敏，只需 10ng DNA 即可獲得陽性轉換子；最佳效率在 0.1-3 μg 範圍內。	簡單易用 只需 10 ng 的質粒 DNA 即可使用。靈活運用於任何酵母菌株  足夠進行超過 100 次標準轉換
L4158	Lithium acetate dihydrate	Facilitate yeast transfection	Part of the BioXtra product line
T9285	Tris-EDTA buffer solution TE Buffer 含 1 M Tris-HCl (pH ~8.0），含有 0.1 M EDTA。	TE (Tris EDTA) 緩衝液常用於分子生物學實驗室。	適合儲存RNA和DNA，包括純化的質粒DNA儲備
D8418	二甲基亚砜(DMSO)	可用於轉換的緩衝液製備、DEAE-葡聚糖介導的細胞轉染和含有 40-50 % PEG 的細胞融合程序；以及其他幾種應用	本產品可提高轉換效率 2 至 5 倍 本產品不含 DNases、RNases、磷酸酶和蛋白酶。
D9156<	Deoxyribonucleic acid (DNA), single stranded from salmon testes	此DNA經乙醇沉澱及聲波處理後產生單鏈片段，可與587及831個碱基對的標記片段共同整合

酵母轉換協議

協議概述

LiAc轉換方法包括三個主要步驟：製備有能力的酵母細胞、用質粒DNA進行轉換，以及隨後的培養以篩選轉換子。酵母轉化體通常使用輔助營養標記進行篩選；因此，篩選轉化體時要使用適當的合成滴液培養基。

所需試劑：

儲備溶液
50 % 聚乙二醇溶液（mol wt ~36,500）
1 M Tris-HCl 和 0.2 M EDTA, pH 8.0 (TE Buffer) (Catalog Number T9285)
1 M Lithium acetate, pH 7.5 (Catalog Number L4158)

1x TE-LiAc solution
10 mM Tris-HCl, pH 8.0, with 1 mM EDTA and 0.1 M lithium acetate

PEG-TE-LiAc solution
40 % PEG in 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, with 1 mM EDTA and 0.1 M 乙二胺四乙酸鋰

酵母菌轉化

1. 製備 YPD 和合成完全 (SC) 脫落培養基平板，並分別進行高壓消毒（表 1 和表 2 ）。
2. 將平板上的酵母細胞接種到 100 mL 無菌瓶中的 20 mL YPD 培養基。
3. 振動培養過夜。
4. 將上述培養液中的細胞稀釋到 100 mL YPD 培養液中，直到 OD600 為 0.3。
5. 輕輕地擠壓細胞。
6. 重悬於 7-8 mL 的 1x TE-LiAc 溶液中，在 23 °C 下旋轉 1-1.5 hours.
7. 在指定用于转化的无菌微量离心管和一个用于阴性对照的无菌微量离心管中加入 10 µL 10 mg/mL 的鲑鱼睾丸 DNA（目录编号 D9156）.
8. 在指定用于转化的无菌微量离心管和一个用于阴性对照的无菌微量离心管中加入 0.
9. 加入 600 µL 新製備的 PEG-TE-LiAc 溶液，攪拌，並在 30 °C 下震盪培養 30 分鐘。
10. 選項 - 可加入 10% (v/v)的 DMSO (目錄編號 D8418)；接著在 42 °C 下熱衝擊 15 分鐘。
11. 旋轉 3 秒鐘，將細胞重懸於無菌水中，並使用適當的 SC 脫落培養基進行平板。
    

注意：請參閱培養酵母菌的生長規範，以及以下分離轉換子的章節。

酵母轉化體的分離

酵母轉化體通常使用 URA3 互補法進行選擇，雖然利用氨基酸進行互補的技術和 URA3 互補法也可以用於酵母轉化體的分離。nbsp;藍白篩選 方法也可以使用。

在基於 URA3的選擇技術中，質粒 DNA 有酵母 URA3基因的正常拷貝。基因以及 URA3啟動子；而酵母突變株缺乏 URA3 等位基因。因此，用該質粒轉化的酵母細胞具有URA3基因的功能拷貝，這使它們能夠在不含尿嘧啶的酵母合成脫落培養基（目錄編號 Y1501）上生長。

圖 1. 酵母轉化

材料

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參考資料

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4. Schiestl RH, Gietz RD. 1989. High efficiency transformation of intact yeast cells using single stranded nucleic acids as a carrier. Curr Genet. 16(5-6):339-346. https://doi.org/10.1007/bf00340712

5. Li B, Fields S. 1993. Identification of mutations in p53 that affect its binding to SV40 large T antigen by using the yeast two?hybrid system. FASEB j.. 7(10):957-963. https://doi.org/10.1096/fasebj.7.10.8344494