酵母轉化套件

產品代碼：YEAST1

產品說明

酵母中質粒的選擇是基於輔助突變株的使用，這些突變株在沒有特定培養基成分（氨基酸、嘌呤或嘧啶）的情況下不能生長。用突變基因互補的質粒進行轉換，可使轉換株在缺乏所需成分的培養基上生 長。酵母細胞在緩衝乙酸鋰溶液中培養，使其具有轉化能力。然後將細胞與轉化 DNA 和載體 DNA 一起在含有聚乙二醇 (PEG) 的溶液中培養，即可進行轉化。酵母轉化試劑盒使用的是由 Ito, et al.(1983).所提供的方案包括 Hill et al. （1991）、Gietz et al. （1992）（方案 1）和 Elble（1992）（方案 2）建議的修改。

元件

本套件足以進行超過 100 種標準轉換。

Transformation Buffer 100 mM lithium acetate, 10 mM Tris-HCl, pH 7.6, and 1 mM EDTA Product No.T0809	100 ml
PLATE Buffer 40% PEG, 100 mM lithium acetate, 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA Product No.P8966	100 ml
取自鮭魚睪丸的脫氧核糖核酸，10 mg/mL 產品型號。D9156	2 x 1 ml
Control Yeast Plasmid DNA pRS316, carrying the ura gene Product No.C4959	10 μg
不含尿嘧啶的酵母合成脫落培養基添加劑 Product No.Y1501	1克

Reagents Required But Not Provided

• 無菌水
  
• 葡萄糖，50%溶液，由 Product No.G5400, sterilized by 0.2 μm 過濾
  
• 甘油，50% 溶液，由 Product No.G5516, 經高壓滅菌
  
• DMSO, Product No.D8418（選擇性）
  
• 細菌蛋白胨，產品編號 P0556
  
• 酵母提取物，產品編號Y1625
  
• 細菌瓊脂，產品編號 A5306
  
• 不含氨基酸的酵母氮基，產品編號.Y0626
  
• 不含特定氨基酸或嘧啶的酵母合成脫落培養基添加劑：
  
  • 不含亮氨酸和色氨酸的培養基，產品型號Y0750
  • Medium without leucine, Product No.Y1751
  • 不含色氨酸的中藥產品，產品編號：Y1876Y1876
  • 不含組氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶的中號，產品編號。Y2001
• 用於轉換的酵母細胞

注意事項與免責聲明

本產品僅供 R&D 使用，不得用於藥物、家用或其他用途。請參閱安全資料表，以瞭解有關危害和安全處理實務的資訊。

儲存/穩定性

將試劑盒儲存於 -20 °C。解凍後，將 Transformation Buffer、Plate Buffer 及 Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplement Without Uracil 於室溫下儲存。

程序

培養基溶液的製備

1. YPD培養基和板 - 用於在非選擇性條件下保持酵母菌株。
   • 20 g/L 細菌蛋白胨
   • 10 g/L 酵母抽提物
   • 20 g/L 細菌瓊脂（用於平板）

   加入960 mL去離子水，高壓滅菌 15分鐘，再加入40 mL 50%無菌（0.2 µm過濾）
   的葡萄糖溶液。

2. 合成完整（SC）滴出板 - 用於選擇不需要 某種培養基
   成分（氨基酸、嘌呤或嘧啶）的酵母菌株 。
   • 0.8-1克/升：適當的酵母合成脫落培養基添加劑
     (Product No.Y1376, Y1751, Y1876, Y1501, Y2001)
   • 6.7 g/L：不含氨基酸的酵母氮基
   • 20 g/L：細菌瓊脂

加入960 mL去離子水，高壓滅菌15分鐘，再加入40 mL 50%無菌（0.2 µm過濾）葡萄糖溶液。酵母瓊脂溶液高壓滅菌時間過長會使平板變軟。另外，如果瓊脂與酵母氮基分開高壓滅菌，則培養基可高壓滅菌更長的時間。

酵母菌株的保存

酵母菌株可在 4 °C 下在用 Parafilm^® 密封的 YPD 或 SC 平板上保存 2-3 個月。若要長期保存，可從新培養的平板上刮取大量接種物，並重懸於 1 mL 無菌 15% 甘油中。

要使冷凍的酵母存貨復活，用無菌牙簽或細菌針刮取冷凍存貨，並在適當的平板（YPD 或 SC）上作條紋。避免解凍存貨。

轉換規程 1

製備合格細胞

1. 將 YPD 平板上的酵母接種到 100 mL 無菌瓶中的 20 mL YPD 培養基。
2. 在 30 °C 下振荡（200-250 rpm）過夜生長。培養物應達到靜止期（OD₆₀₀
3. 將培養物稀釋到 500 mL 無菌瓶中的 100 mL YPD 培養基，使 OD₆₀₀ ∼0.3。在 30 °C 下震盪生長 3-6 小時。培養物的 OD₆₀₀ 至少應翻倍一次，且不應超過 1.5。
4. 室溫下，在 GSA 或同等轉子中以 5,000 rpm 離心 5 分鐘，收穫細胞。
5. 丟棄上清液，將細胞重懸於 50 mL 無菌水中。
6. 按步驟 4 重複離心。
7. 丟棄上清液，將細胞重懸於 1 mL Transformation Buffer（產品編號 T0809）中。注意：細胞現在已準備好進行轉換。最好立即使用細胞，但也可在 4 °C 下保存 1 周，能力逐漸下降，或加入甘油至 15%，將細胞冷凍保存在 -70 °C 下。

Plasmid Transformation

1. 設置所需數量的無菌 1.5 mL 微離心管，每個轉換用一個，陰性對照用一個。
2. （產品編號：D9156）。
3. 在每個試管中加入 0.1 µg 要研究的酵母質粒 DNA（1 µL 的 0.1 mg/mL）：提供對照酵母質粒 DNA（產品編號 C4959）。該質粒可作為陽性 ura 缺乏的酵母菌株和所提供的 Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplement Without Uracil (Product No. Y1501)。
4. 加入 100 µL 合格細胞，攪拌。
5. 加入 600 µL PLATE 緩衝液（產品編號 P8966），攪拌。
6. 在 30 °C 下震動培養 30 分鐘：加入 DMSO 至 10%。
7. 在 42 °C 的加熱塊或水浴中加熱震盪 15 分鐘。
8. 在微離心機中旋轉 3 秒鐘，取出上清液。
9. 將細胞重懸於 500 µL 無菌水中。
10. 將 100 µL 細胞平鋪於適當的 SC 選擇性平板上，不添加所需的補充劑。
11. 在 30 °C 下孵育（面朝下）2-3 天，直到出現菌落。

轉換方案 2（短）

本方案比方案 1 更快速，但效率較低。當只需要少量的轉換子時，它非常方便，但不建議用於文庫或其他珍貴 DNA 的轉換。

1. 從新的平板上刮取滿滿一圈細胞（在 4 °C 下保存 2 週的平板上的細胞也適用）到微離心管中。
2. 用 0.5 mL Transformation Buffer（產品編號 T0809）重懸細胞。
3. 在微離心管中旋轉 5 秒。
4. 移去上清液，在管中留下 50-100 µL 的緩衝液。
5. 每管加入 10 µL 10 mg/mL 鮭魚睪丸 DNA（產品 Code D9156）。
6. 加入 1 µg 待研究的酵母質粒 DNA，渦旋 10 秒。
   注意：提供對照酵母質粒 DNA（產品編號 C4959）。註：提供的對照酵母質粒 DNA（產品編號 C4959）僅用於測試轉換技術的陽性對照，使用ura缺失的酵母菌株和提供的不含尿嘧啶的酵母合成脫落培養基添加劑（產品編號 Y1501）。
7. 加入 600 µL PLATE 緩衝液（產品編號 P8966）並攪拌。
8. 可選：在 42 °C 加熱塊或水浴中加熱震盪 15 分鐘。
9. 在微離心機中旋轉 3 秒鐘，取出上清液。
10. 用 500 µL 無菌水重懸細胞。
11. 將 100 µL 平鋪在適當的 SC 選擇性平板上，不添加所需的補充劑。
12. 在 30 °C 下孵育（面朝下）2-3 天，直到出現菌落。

參考資料

1. Ito H, Fukuda Y, Murata K, Kimura A. 1983. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations.. 153(1):163-168. https://doi.org/10.1128/jb.153.1.163-168.1983

2. Hill J, Donald KG, Griffiths DE. 1991. DMSO-enhanced whole cell yeast transformation. Nucl Acids Res. 19(20):5791-5791. https://doi.org/10.1093/nar/19.20.5791

3. Gietz D, Jean AS, Woods RA, Schiestl RH. 1992. Improved method for high efficiency transformation of intact yeast cells. Nucl Acids Res. 20(6):1425-1425. https://doi.org/10.1093/nar/20.6.1425

4. Elble R. 1992. A simple and efficient procedure for transformation of yeasts. Biotechniques.. 1(13):18-20.