協議指南：使用抗體對整片有機體進行免疫螢光染色

有機體具有複雜的三維結構，並嵌入 ECM水凝胶 使得表征变得困难。使用抗體對器官組織進行免疫螢光 (IF) 染色，可以觀察細胞行為、增殖、分化、細胞健康和特性的分子標記。整片免疫染色是針對小片組織而不需切片，方法與免疫細胞化學 (ICC) 或免疫組織化學 (IHC) 冷凍切片染色非常相似。器官組織的整片染色可用於 抗體 表徵。在此類器官染色方案中，我們將詳細介紹固定、通透和染色全裝類器官的方法，以便使用免疫螢光共聚焦顯微鏡進行分析。

圖 1. 使用抗體對器官組織進行免疫螢光。用乙酰基-α-微管蛋白 (A)、α-碳酸酐酶 IV (B) 和 Sox-9 (AB5535)(C)的抗體染色的人類上皮腸和肺器官組織。

類器官染色規範

1. 從類器官培養物中取出培養基，用 1X PBS 輕輕洗滌 2 次 (D8537)。
2. 用 15-20 mL 4% PFA（1.00496）在室溫下固定 30-60 分鐘，將 30-40 個類器官 Matrigel 圓頂放在 10 cm 的平皿中。  
   注意：Matrigel 在 PFA 中固定時會部分溶解. 
3. 偶爾旋轉平皿，使 Matrigel 圓拱脫離，並使有機體從 Matrigel 中釋放出來。 
   注意：不是所有的有機體都會從 Matrigel 中釋放出來。
4. 將 10 cm 皿中的 15-20 mL 固定液倒入 50 mL 錐形管中，讓有機體在重力作用下沉降在管底（約 10-15 分鐘）。
5. 當有機體在重力作用下沉降到 50 mL 錐形試管底部後，小心吸出固定液，盡量避免在此過程中吸出有機體小球。
6. 將 15-20 mL 的 1X PBS (D8537)加入步驟 4 的平皿中，並在室溫放置 15-20 分鐘。
7. 15-20分鐘後，攪動平皿使Matrigel穹頂進一步脫離，然後將1X PBS (D8537)倒入含有步驟5所得類器官顆粒的50 mL圓錐管中。
8. 重複步驟 5-7 三次。
9. 在不傷害類器官沉團的情況下攪拌溶液，然後在盛有類器官沉團的 50 mL 圓錐形試管的一側注入 5 mL 1X PBS (D8537)，攪拌試管使類器官沉團重懸。
10.  直接將含有類器官團塊的 5 mL 1X PBS (D8537)倒入含有未脫離類器官 Matrigel 圓頂的 10 cm 皿中。
11. 在 50 mL 錐形管中再加入 5 mL 1X PBS (D8537)，盡可能多地收集類器官團塊，並直接倒入含有類器官的 10 cm 皿中。
12. 如果不立即使用，請將 10 cm 皿用保鮮膜封好，放在 4 °C 的冰箱中保存 1 個月。
13. 準備好進行免疫螢光染色時，從冰箱中取出裝有固定的器官組織的 10 cm 皿，在解剖顯微鏡下觀察。
14. 剪下 1 mL 移液器吸頭的頂端，使管徑夠大，以便吸起有機體而不會剪切或折斷有機體。
15. 將有機體（1-4）轉移至 8 孔室玻片中，用 P-200 移液器移除殘留的 1X PBS (D8537)。  避免吸起有機體並透過未切割的 P-200 吸頭剪切它們。
16. 用 0.5 mL Blocking Buffer（5% horse serum + 0.5% Triton X-100 in 1X PBS），4 °C過夜或室溫 2-4 小時。   注意：建議使用與第二抗體宿主相同物種的血清。
17. 用 P-200 移液器從含有器官組織的室內玻片上移除阻斷緩衝液。  避免通過 P-200 吸頭向上移動器官組織。
18. 在阻斷緩衝液中準備一抗(300-500 µL)或直接結合抗體(300-500 µL)。
19. 將稀釋後的抗體加入含有器官組織的適當標記孔中。
20. 允許在 4 °C 孵育過夜。
21. 第二天，用 1X PBS 洗 3 次（D8537），每次洗 10-15 分鐘。注意：如果使用直接結合的抗體，樣品可以在共焦顯微鏡上成像。
22. 如果使用未結合的一抗，請在阻斷緩衝液中準備二抗（300-500 µL），並用於適當標記的樣品上。
23. 允許在 4 °C 下用二抗染色過夜。
24. 第二天，用 1X PBS 洗 3 次（D8537），每次洗 10-15 分鐘。
25. 用 P-200 移液器從每個含有器官組織的孔中移除阻斷緩衝液。
26. 準備核染色，在 1X PBS 中加入 5 µg/mL 的 DAPI (D9542)（每個樣本 300-500 µL）。
27. 每個樣本加入 DAPI 染色液，室溫孵育 15-20 分鐘。
28. 用 1X PBS (D8537)清洗 3 次，每次 10-15 分鐘。