頂空 SPME-GC/MS 分析啤酒花和大麻中的萜烯類化合物

Katherine K. Stenerson, Principal Scientist

Article from Analytix Reporter - Issue 3

節概述

• Experimental
• SPME 方法優化
• 啤酒花樣品中的萜烯類化合物
• 結論

在此應用中，headspace-SPME 結合 GC/MS 用於分析普通啤酒花和大麻中的一些萜烯類化合物。

萜烯類化合物是由某些植物合成的小分子。萜烯這個名稱來自於松脂，松脂中含有高濃度的這些化合物。萜烯分子是由異戊二烯單元以頭對尾的結構連接而成（圖 1）。然後根據結構中異戊二烯單元的數量進行分類（表 1）。萜烯的構型可以是環狀或開放式，並且可以包含雙鍵、羥基、羰基或其他官能基團。如果萜烯中含有 C 和 H 以外的元素，則稱為萜類化合物。¹

圖 1. 異戊二烯單元

表 1. 萜烯類的分類

分類	異戊二烯單位數
單萜	2個
側萜	3個
二萜	4
三萜	6
四萜	8

萜烯存在於從植物中提煉出來的精油中，通常會給植物或其精油帶來特有的芳香。例如，存在於檸檬、柳橙、胡蘿蔔素和其他植物油中的 d-柠檬烯具有檸檬般的氣味。精油與其組成成分萜烯和萜類化合物已被應用在治療上，稱為芳香療法，可幫助舒緩焦慮、憂鬱和失眠等症狀。² 這導致含有這些化合物的植物被用在精油、茶和補藥等製劑中。

使用萜烯譜進行植物鑑定

The （大麻或大麻）植物含有超過 100 種不同的萜烯和萜類化合物，包括單、倍、二和三萜烯，以及其他萜類化合物。³ 雖然萜烯譜不一定表示大麻樣本的地理來源，但它可以用於法證應用，以判斷不同樣本的共同來源。⁴ 此外，不同的大麻品種有不同的香氣和味道；這是由於特定萜烯含量不同所造成的。⁵ Humulus lupulus （普通啤酒花）和大麻都是大麻科（Cannabaceae）的成員。⁶ 因此，兩者所含的萜類化合物有相似之處。萜烯賦予這兩種植物商品特有的感官特性，對大麻來說，當大麻花蕾加熱或蒸發時，會產生特有的香氣。⁷

實驗性

乾燥的大麻樣本是由 Dr. Hari H. Singh 博士提供的。Hari H. Singh 博士提供，他是美國國家衛生研究院 (National Institute of Health) 的美國國家藥物濫用研究所 (National Institute on Drug Abuse) 化學與實驗室生理系統研究分部 (Chemistry & Physiological Systems Research Branch) 的項目主任。樣品的萃取品種不明。未知品種的啤酒花是從網上購買的。Cascade 和 US Golding 兩種酒花的顆粒從當地的自家釀酒用品店購買。色譜分離在 Equity®-1 毛細管氣相色谱柱上進行，並使用保留指數和光譜庫匹配進行鑑定。

Analysis and Quantification of Terpenes by SPME GC-MS

SPME涉及到使用塗有萃取相的纖維，將其暴露在樣品中以萃取萜烯定量的目標化合物。然後將纖維直接插入氣相色譜儀 (GC) 的注入器中，在此化合物會被 GC 柱解吸並分離。分離出的化合物再由質譜儀 (MS) 進行檢測和鑑定。透過分析質譜圖中的峰區或峰高，可判斷樣品中每種萜烯的豐度。然後對 SPME GC-MS 分析獲得的數據進行處理和分析，以量化樣品中存在的萜烯。

SPME 方法優化

萜烯分析的 SPME 方法是以乾燥啤酒花樣品（0.2 g 在 10 mL 小瓶中）。⁸該分析的 GC/MS 結果如圖 2所示。這套初始參數使用 100 µm PDMS 纖維、1 g 樣品大小，並在萃取前於室溫下平衡 60 分鐘。之後，樣品尺寸縮小到 0.2 g，平衡溫度升高到 40 °C。溫度升高後，平衡時間從 60 分鐘縮短到 30 分鐘，而靈敏度沒有降低（圖 3 和 4）。最初使用的提取時間為 20 分鐘，並評估了 10 分鐘的較短提取時間。然而，我們注意到靈敏度有所降低，因此提取時間維持在 20 分鐘。接著評估了 DVB/CAR/PDMS 纖維 (圖 5)。不出所料，這種纖維萃取了更多較輕的化合物，通過 MS 光譜匹配，這些化合物被識別為短鏈醇和酸。

圖 2. 頂空 SPME-GC/MS 分析乾燥啤酒花（100 µm PDMS 纖維，1 g 樣品）

樣品/基質：	1公克磨碎的酒花
SPME 纖維：	100 µm PDMS (57341-U)
樣品平衡：	60 分鐘，室溫
萃取：	20分鐘，頂空，40 °C
解吸過程：	3分鐘，270 °C
纖維後烘烤：	3分鐘，270 °C
色柱：	Equity®-1，60 m x 0.25 mm I.D、0.25 µm (28047-U)
烤箱：	60 °C (2 min), 5 °C/min 至 275 °C (5 min)
Inj.:	270°C
偵測器：	MSD
MSD 介面：	300°C
掃描範圍：	全掃描，m/z 50-500
載氣：	氦氣，1 mL/min 恆定流量
襯墊：	0.75 mm ID SPME

圖 3. 頂空 SPME-GC/MS 分析乾燥啤酒花（100 µm PDMS 纖維，0.2 g 樣品）

條件與圖 2 相同，除了：

樣品/基質：0.2克磨碎的啤酒花

圖 4. 頂空 SPME-GC/MS 分析乾燥啤酒花，提高樣品等化溫 (100 µm PDMS 纖維，0.2 g 樣品)

條件與圖 2 相同，除了：
樣品/基質：	0.2 g 磨碎的酒花
样品平衡：	30 min, 40 °C

圖 5. 頂空 SPME-GC/MS 分析乾燥啤酒花，增加樣品等化溫 (DVB/CAR/PDMS Fiber, 0.2 g 樣品)

除了：
樣品/基質：	0.2 g 研磨啤酒花
SPME 纖維：	50/30 µm DVB/CAR/PDMS (57298-U)
樣品平衡：	30分鐘，40 °C
樣品/基質：	0。2 g 磨碎的酒花
樣品平衡：	30 分鐘，40 °C

使用 GC/MS 鑑定萜烯類化合物

使用 DVB/CAR/PDMS 纖維，以最佳化的 SPME 方法分析啤酒花和大麻樣品。使用 MS 光譜比對 Wiley 和 NIST 圖庫中的參考光譜來指定峰值鑑定。根據保留指數進行確認鑑定。使用在相同氣相色譜條件下分析的 n烷標準物，計算每個樣品中已識別化合物的保留指數。將此數據與已公佈的值進行比較（表 2 和表 3），並指定最終鑒定，如 圖 6 和圖 7所示。

啤酒花样品中的萜烯类化合物

对于干啤酒花样品（图 5圖 5）中，萜烯類應該以β-月桂烯、葎草烯和香葉烯為主，它們是酒花和酒花油中典型的芳香化合物。⁹ 儘管鑑定出了茶花烯，但β-月桂烯和葎草烯的含量卻不高，不足以通過文庫檢索檢出。¹⁰ 分析的酒花品種不明，因為包裝上沒有標明。

為了比較，我們對兩種不同品種的顆粒酒花進行了研磨後的樣品分析。

這些樣品呈現綠色，比乾花具有更多特徵的酒花氣味。對這些樣品的分析顯示出特徵的萜烯譜，兩種樣品中都含有高水平的β-月桂烯、香葉烯和葎草烯（圖 6）。SPME 方法能夠檢測出兩個啤酒花品種之間萜烯譜的差異。例如，在 Cascade 酒花中發現了法尼烯（峰值 18），但在美國 Goldings 酒花樣品中卻因含量太低而無法確認。卡斯卡特啤酒花中的法尼烯含量預計為總油分的3-7%，而在美國金頂啤酒花中的含量應為<1%。¹³

大麻樣品中的萜烯

在大麻樣品（圖 7）中識別出的萜烯類在 表 3 中列出。^4,8  圖 7 （除峰 7 外）中的峰 1-27 是 單萜和單萜烯。後洗脫的峰包括sequiterpenoid的sequiterpenes和caryophyllene oxide。最豐富的萜烯類化合物是香葉烯。這種化合物的主要成分可能是由於所測試的特定大麻品種，和/或所測試的樣品是乾燥的。⁴ 因此，揮發性較高的單萜烯類和萜烯類化合物的含量預期會較少，這在某種程度上是可以觀察到的。在單萜和萜類化合物中，含量最高的是α-蒎烯和d-柠檬烯。

表 2. 利用 MS 光譜庫匹配和保留指數鑑定啤酒花顆粒中的萜烯類。

Peak No.	RT（最小值）	名稱	RI（計算值）	參考文獻	參考文獻
1	8.58	己醛	-	780	11
2	12.84	α-Pinene	939	12.942	11
3	13.28	Camphene	953	954	11
4	13.71	6-甲基-5-庚烯-2-酮	966	13.968	11
5	14.1	β-Pinene	979	981	11
6	14.41	β-Myrcene	988	14.986	11
7	15.32	Cymene	1018	1020	11
8	15.65	d-Limonene	1030	1030	11
9	15.98	β-Ocimene	1041	1038	11
10	16.72	cisLinalool oxide	1066	1068	11
11	17.49	芳樟醇	1089	1092	11
12	21.86	香葉醇	1239	1243	11
13	25.28	乙酸香葉醇酯	1363	1364	11
14	25.85	α-Ylangene	1384	1373	8
15	25.97	α-Copaene	1388	1398	11
16	27.22	茶楊烯	1437	1428	11
17	27.4	trans-α- 佛手柑烯 + 未知	1445	12
18	17.63	trans-β-Farnesene	1454	8
19	28.11	胡麻烯	1473	1465	11
20	28.41	γ-Muurolene	1484	1475	11
21	28.45	γ-Selinene	1486	1472	12
22	28.68	異丁酸香葉醇酯	1495	1493	11
23	28.79	β-Selinene	1499	1487	8
24	28.94	α-Muurolene	1505	1500	11
25	28.97	α-Selinene	1507	1501	12
26	29.31	γ-Cadinene	1521	1518	11
27	29.37	菖蒲	1524	1518	11
28	29.45	Δ-Cadinene	1527	1524	11
29	30.93	氧化茶鹼	1590	1584	8
30	31.5	氧化胡麻烯	1614	1599	12

圖 6. 使用最終優化方法進行啤酒花顆粒的頂空 SPME-GC/MS 分析

峰洗脫順序列於表 2。
條件同圖 2，除了：
樣品/基質：	0.5 g 磨碎的酒花（酒花顆粒）
SPME 纖維：	50/30 µm DVB/CAR/PDMS (57298-U)
樣品平衡：	30分鐘，40 °C

圖 7. 使用最終優化方法進行頂空 SPME-GC/MS 分析乾燥大麻

峰洗脫順序列於表 3。
與  圖 2  除外：
樣品/基質：	0.5 g 經乾燥研磨的大麻
SPME 纖維：	50/30 µm DVB/CAR/PDMS (57298-U)
樣品平衡：	30分鐘，40 °C

表 3. 利用 MS 光譜庫匹配和保留指數鑑定乾燥大麻中的萜烯類化合物

Peak No.	RT（最小值）	名稱	RI（計算值）	參考文獻	參考文獻
1	8.57	己醛	-	-	-
2	10.05	己烯-1-醇	-	-
2	10.-	-
3	10.89	2-Heptanone	-	-
3	10.-	-
4	12.56	α-Thujene	928	12.938	11
5	12.86	α-Pinene + unknown	939	12.942	11
6	13.27	Camphene	953	954	11
7	13.69	6-甲基-5-庚烯-2-酮	966	13.968	11
8	14.09	β-Pinene	979	981	11
9	14.27	β-Myrcene	984	14.986	11
10	15.09	δ-3-Carene	1010	1015	12
11	15.2	α-Terpinene	1014	1012	12
12	15.29	Cymene	1018	1020	11
13	15.6	d-Limonene	1028	1030	11
14	16.42	γ-Terpinene	1056	1057	11
15	16.6	trans-Sabinene hydrate	1062	1078	11
16	16.72	cisLinalool oxide	1066	1068	11
17	17.43	芳樟醇	1087	1092	11
18	18.04	d-Fenchyl alcohol	1107	1110	11
19	18.82	trans-Pinocarveol	1135	1134	12
20	19.59	Borneol L	1161	1164	11
21	19.81	1,8-Methandien- 4-ol	1168	1173	8
22	19.81	p-Cymen-8-ol	1168	1172	12
23	19.92	萜-4-醇	1172	1185	11
24	20.22	α-Terpineol	1181	1185	1111
25	24.2	哌啶酮	1322	1320	12
26	24.76	氧化哌啶酮	1344	1352	12
27	25.85	α-Ylangene	1384	1373	8
28	25.97	α-Copaene	1388	1398	11
29	26.76	γ-Caryophyllene	1419	1403	12
30	27.01	α-Santalene	1429	1428	12
31	27.16	茶楊烯	1435	1428	11
32	27.36	trans-α- 佛手柑烯 + 未知	1443	12
33	27.49	α-Guaiene	1448	1441	8
34	27.56	trans-β-Farnesene	1451	1446	12
35	27.98	胡莫林	1467	1465	11
36	28.17	Alloaromadendrene	1475	1478	11
37	28.25	α-Curcumene	1478	1479	12
38	28.75	β-Selinene	1497	1487	8
39	28.97	α-Selinene	1507	1497	8
40	28.97	β-Bisobolene	1507	1506	8
41	29.13	α-Bulnesene	1514	1513	12
42	30.12	Selina-3,7(11)- diene	1556	1542	12
43	30.94	氧化茶鹼	1590	1595	12
44	31.5	氧化胡麻烯	1614	1599	12
45	32.48	茜草-3, 8(13)-二烯-5-醇 A	1658	1656	12

結論

我們使用簡單的頂空 SPME-GC/MS 方法來分析啤酒花和大麻的萜烯/類萜烯譜。該方法能夠檢測出兩者特有的萜烯和萜類化合物，並能區分不同的啤酒花品種。

參考資料

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11. NIST Chemistry WebBook. [Internet]. Available from: https://webbook.nist.gov/chemistry/

12. Variety Manual USA Hops. Hop Growers of America. [Internet].[cited 19 Sep 2015]. Available from: https://www.usahops.org/