Fosfataza alkaliczna

Fosfataza alkaliczna - testy, masa cząsteczkowa, substraty i struktura

• Fosfataza alkaliczna bydlęca
• E. coli Fosfataza alkaliczna
• Fosfataza alkaliczna z krewetek

.Oferujemy szeroką gamę preparatów fosfatazy alkalicznej (ALP/ALKP) zoptymalizowanych do koniugacja do przeciwciał i innych białek do testów ELISA, Western blotting i wykrywania histochemicznego. Nasza fosfataza alkaliczna BioUltra Grade Alkaline Phosphatase ma bardzo wysoką aktywność specyficzną, dzięki czemu jest szczególnie przydatna do znakowania białek, gdy wymagana jest wysoka czułość.

Western Blotting

Rysunek 1. Białko kontrolne FLAG-BAP wykryte przeciwciałem anty-FLAG i drugorzędowym przeciwciałem znakowanym ALP i wybarwione substratem BCIP/NBT (przy użyciu zestawu ProteoQuest Colorimetric Western Blotting Kit, B6404).

Immunohistochemia

Rysunek 2. Utrwalony w formalinie, zatopiony w parafinie wycinek ludzkiego migdałka wybarwiony monoklonalnym anty-ludzkim IgA i koniugatem anty-mysim IgG ALP przy użyciu SIGMAFAST™ Fast Red TR/Naphthol AS-MX Tablets (nr kat. F4523) jako substratu. 40x

Nasze produkty są również wykorzystywane do defosforylacji kazeiny i innych białek. ALKP może być stosowany do defosforylacji 5'-końca DNA lub RNA, aby zapobiec samoligacji. DNA lub RNA mogą być również znakowane fosforanem znakowanym radioaktywnie (za pośrednictwem kinazy polinukleotydowej T4) po defosforylacji za pomocą ALKP.

Bovine Alkaline Phosphatase

Bovine intestinal ALP jest dimeryczną, pochodzącą z błony glikoproteiną.^1-3 Istnieją co najmniej trzy izoformy, które zazwyczaj posiadają dwa N-związane i jeden lub więcej O-związanych glikanów na monomer.² Enzym wymaga do aktywności cynku i dwuwartościowych jonów magnezu lub wapnia.⁴

Enzym ma szeroką specyficzność dla estrów fosforanowych alkoholi, amin, pirofosforanów i fenoli. Jest rutynowo stosowany do defosforylacji białek i kwasów nukleinowych.^5-7

K_M: 1.5 × 10^-3 M (fosforan p-nitrofenylu), 19 × 10^-3 M (fosfoenolopirogronian)

Masa cząsteczkowa:^2,3 140-160 kDa (MW dimeru)
E₂₇₈1%: 7,6-10,5
Punkt izoelektryczny:^4,8,9 Izoenzymy o pI w zakresie 4,4-5,8

pH Optimum: Enzym jest najbardziej stabilny w zakresie pH 7,5-9,5.³ Optymalne pH dla aktywności enzymatycznej to pH 8-10. Optymalne pH zmienia się w zależności od substratu, stężenia substratu i stężenia jonów.⁸ Aktywność enzymu dla tego produktu jest określana przy pH 9.8 (diethanolamine buffer enzyme assay).

Wpływ temperatury na aktywność i stabilność

Inhibitory bydlęcej fosfatazy alkalicznej

Środki chelatujące, arsenian, cysteina, jod, fosforan nieorganiczny, pirofosforan, fosforan diizopropylu, trifenylofosforan, fluorofosforan diizopropylu i L-fenyloalanina.^9,10

Lewamizol (numer katalogowy L9756) jest zwykle stosowany do hamowania endogennej aktywności ALKP jednocześnie tylko nieznacznie hamując enzym jelitowy.^11,12

Protokoły testów

• Diethanolamine Assay
  
• Glycine Assay pH 8.8
• Glycine with Zinc Assay
  
• Glycine Assay pH 10.4
  

Definicja jednostki: Jedna jednostka DEA hydrolizuje 1 µmol fosforanu 4-nitrofenylu na minutę przy pH 9,8 w temperaturze 37 °C. W przybliżeniu 3 jednostki DEA równają się jednej jednostce glicyny.

ALP jest również stosowany do określania skuteczności pasteryzacji produktów mlecznych, takich jak mleko i ser. ALP ulega denaturacji pod wpływem temperatury około 72 °C przez co najmniej 15 sekund. Wykazano, że mniej ekstremalne warunki temperaturowe niszczą większość patogenów pochodzących z mleka. Dlatego aktywność ALP może być wykorzystywana do pomiaru skuteczności pasteryzacji. W przeszłości stosowano dwie metody sprawdzania aktywności ALP po pasteryzacji, pierwszą z nich jest test Scharera, który uwalnia i mierzy fenol. Druga metoda jest znana jako Aschaffenberg & Mullen Test. Metoda ta mierzy uwalnianie p-nitrofenolu. W przypadku obu testów negatywne wyniki oznaczają brak aktywności ALP i zniszczenie większości patogenów pochodzących z mleka. Ostatnio opracowano nowe, bardziej czułe techniki oparte na tej samej zasadzie aktywności ALP.

Referencje

1. Hsu HH, Munoz PA, Barr J, Oppliger I, Morris DC, Vaananen HK, Tarkenton N, Anderson HC. 1985. Purification and partial characterization of alkaline phosphatase of matrix vesicles from fetal bovine epiphyseal cartilage. Purification by monoclonal antibody affinity chromatography. J. Biol. Chem..(260):1826-31.

2. NEUMANN H, LUSTIG A. 1980. The Activation of Alkaline Phosphatase by Effector Molecules. A Combined Kinetic and Hydrodynamic Study. Eur J Biochem. 109(2):475-480. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1980.tb04818.x

3. Fosset M, Chappelet-Tordo D, Lazdunski M. 1974. Intestinal alkaline phosphatase. Physical properties and quaternary structure. Biochemistry. 13(9):1783-1788. https://doi.org/10.1021/bi00706a001

4. Besman M, Coleman JE. 1985. Isozymes of bovine intestinal alkaline phosphatase. J Biol. Chem..(260):11190-3.

5. Fernley H. 1971. 18 Mammalian Alkaline Phosphatases.417-447. https://doi.org/10.1016/s1874-6047(08)60378-9

6. Morton RK. 1955. The substrate specificity and inhibition of alkaline phosphatases of cow's milk and calf intestinal mucosa. 61(2):232-240. https://doi.org/10.1042/bj0610232

7. Morton RK. 1955. The action of purified alkaline phosphatases on di- and tri-phosphopyridine nucleotides. 61(2):240-244. https://doi.org/10.1042/bj0610240

8. Latner AL, Parsons M, Skillen AW. 1970. Isoelectric focusing of alkaline phosphatases from human kidney and calf intestine. Enzymologia. 40(1):1-7.

9. Lazdunski M, Brouillard J, Ouellet L. 1965. ÉTUDE DES EFFETS ÉLECTROSTATIQUES SUR LE MÉCANISME D'ACTION CATALYTIQUE DE LA PHOSPHATASE ALCALINE INTESTINALE DE VEAU. Can. J. Chem.. 43(8):2222-2235. https://doi.org/10.1139/v65-300

10. Harlow E, Lane D. 1988. Antibodies: A Laboratory Manual. 1. New York: Cold Spring Harbor Larboratory Press.

11. STAGNI N, VITTUR F, DEBERNARD B. 1983. Solubility properties of alkaline phosphatase from matrix vesicles. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 761(3):246-251. https://doi.org/10.1016/0304-4165(83)90072-7

12. van Belle H. 1972. Kinetics and inhibition of alkaline phosphatases from canine tissues. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 289(1):158-168. https://doi.org/10.1016/0005-2744(72)90118-0

13. Roger DM. 1938. Practical Experience with the Scharer Rapid Field Test for Pasteurization. Am J Public Health Nations Health. 28(11):1325-1327. https://doi.org/10.2105/ajph.28.11.1325

 

E. coli Fosfataza alkaliczna

E. coli ALKP jest dimerycznym, nieglikozylowanym białkiem, które rezyduje głównie w przestrzeni peryplazmatycznej E. coli. Istnieją co najmniej trzy izoformy. Enzym wymaga cynku i jest dodatkowo aktywowany przez jony magnezu do aktywności.^1-3 Podobnie jak enzym bydlęcy, E. coli enzym ma szeroką specyficzność dla estrów fosforanowych.¹

K_M: 0.02 × 10^-3 M (fosforan p-nitrofenylu)⁴
Waga cząsteczkowat:² 89 kDa (MW dimeru)
E₂₇₈1%: 7,6-10,5²
Punkt izoelektryczny:⁵ Izoymy o pI w zakresie 4.5
pH Optimum: 8.0⁵

1. Reid TW, Wilson IB. 1971. 17 E. coli Alkaline Phosphatase.373-415. https://doi.org/10.1016/s1874-6047(08)60377-7

2. Anderson RA, Vallee BL. 1975. Cobalt(III), a probe of metal binding sites of Escherichia coli alkaline phosphatase.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 72(1):394-397. https://doi.org/10.1073/pnas.72.1.394

3. Savchenko A, Wang W, Vieille C, Zeikus J. 2001. [26] Alkaline phosphatase from Thennotoga neapolitana.298-305. https://doi.org/10.1016/s0076-6879(01)31067-4

4. Boulanger RR, Kantrowitz ER. 2003. Characterization of a MonomericEscherichia coliAlkaline Phosphatase Formed upon a Single Amino Acid Substitution. J. Biol. Chem.. 278(26):23497-23501. https://doi.org/10.1074/jbc.m301105200

5. Garen A, Levinthal C. 1960. A fine-structure genetic and chemical study of the enzyme alkaline phosphatase of E. Coli I. Purification and characterization of alkaline phosphatase. Biochimica et Biophysica Acta. 38470-483. https://doi.org/10.1016/0006-3002(60)91282-8

 

Shrimp Alkaline Phosphatase

Shrimp ALKP jest białkiem dimerycznym o masie cząsteczkowej około 58 kDa, określonej metodą SDS-PAGE.

Enzym Shrimp denaturuje w niższej temperaturze niż inne źródła enzymu i dlatego jest zalecany do defosforylacji DNA i RNA, gdy wymagany jest etap inaktywacji cieplnej po reakcji.

Fosfataza alkaliczna z krewetek, nr kat. No. A2237

Procedura defosforylacji DNA