Analiza Western Blot immunoprecypitacji (IP-Western)

Analiza IP-Western pozostaje popularną techniką identyfikacji interakcji białko-białko i identyfikacji nieznanych białek w kompleksie wielobiałkowym. Etapy obejmują lizę komórek, tworzenie kompleksu przeciwciało-antygen (immunologicznego), wytrącanie kompleksów immunologicznych i analizę metodą Western blotting.

Czytaj więcej

• Wysokie tło.
• Brak wyeluowanego białka docelowego lub niewystarczająca ilość wyeluowanego białka docelowego
• Dodatkowe pasmo(a) przy 50 kDa i 20 kDa na końcowej Western Blot, które może maskować pasmo zainteresowania
• Przewodnik wyboru kulek do immunoprecypitacji

Wysokie tło

.

Rysunek 1. Wysokie tło, prowadzące do niespecyficznych pasm na Western blot.

Możliwe Przyczyna	Remedy
Niespecyficzne wiązanie z kulkami	W przypadku stosowania kulek agarozowych wykonaj etap wstępnego oczyszczania. Dodanie niepowlekanych kulek agarozowych (przed dodaniem kulek powlekanych przeciwciałem) do mieszaniny białek usuwa białka, które niespecyficznie wiążą się z agarozą. Upewnij się, że kulki są prawidłowo zablokowane za pomocą BSA przed dodaniem przeciwciała. Zmniejsz objętość kulek.
Bufor płuczący nie jest wystarczająco rygorystyczny	Przełącz się na bufor o wyższej rygorystyczności, taki jak ten oparty na RIPA.
Niespecyficzne wiązanie przeciwciał	Zmniejsz czas inkubacji, objętość/stężenie lizatu i/lub stężenie przeciwciał. Użyj bardziej specyficznego przeciwciała.
Nieodpowiednie płukanie	Dodaj więcej płukań i/lub płucz przez dłuższy czas. Zwiększyć surowość buforu płuczącego. Odwrócić probówkę kilka razy, aby zapewnić odpowiednie płukanie.

No Target Protein Eluted, or Not Enough Target Protein Eluted

.

Możliwa przyczyna	Środek zaradczy
Degradacja białek, defosforylacja i denaturacja podczas etapu lizy	Wykonaj wszystkie kroki w temperaturze 4 °C. Zapewnić odpowiednią ilość inhibitorów proteazy i fosfatazy.
Zbyt rygorystyczny bufor do lizy	Przełącz na bufor o średniej lub niskiej restrykcyjności, taki jak bufor na bazie NP-40, Triton® X-100 lub PBS.
Przeciwciało niezwiązane z kulkami	Sprawdzić, czy kulki są prawidłowo dopasowane do izotypu przeciwciała.
Niewystarczające wiązanie przeciwciała z antygenem	Zwiększyć stężenie przeciwciała dodanego do mieszaniny lizatu i/lub stężenie kulek. Inkubować przeciwciało i mieszaninę lizatu przez dłuższy czas. W przypadku niskiego stężenia białka lub niskiego powinowactwa przeciwciało-białko, należy przejść z bezpośredniej metody immunoprecypitacji na metodę pośrednią.
Kulki agarozowe przypadkowo usunięte podczas etapu wytrącania./td>	Upewnij się, że kulki agarozy nie zostały zassane do pipety. Używaj kulek magnetycznych zamiast kulek agarozowych, aby zminimalizować/wyeliminować utratę kulek.
Mysie IgG lub kurze przeciwciało nie wiąże się skutecznie z kulkami sprzężonymi z białkiem G lub białkiem A (do pośredniej immunoprecypitacji)	Dodaj przeciwciało pomostowe podczas etapu wytrącania, aby poprawić wiązanie tych przeciwciał z kulkami sprzężonymi z białkiem G lub białkiem A.
Białko docelowe pozostaje na kulkach	Zapewnij odpowiedni typ buforu elucyjnego i pH.
Rozpad kompleksów białkowych (w eksperymentach koimmunoprecypitacji)	Wiruj delikatnie i używaj szerokich końcówek pipety, aby uniknąć rozerwania kompleksów białkowych.

Dodatkowe pasmo(a) o masie 50 kDa i 20 kDa na końcowym Western Blot, które może maskować pasmo zainteresowania

Rysunek 2. W sieciowaniu IP western, ciężkie i lekkie łańcuchy pierwotnego przeciwciała wychwytującego są wykluczane z próbki.

Possible Cause	Remedy
Ciężkie i lekkie łańcuchy przeciwciała pierwotnego są rozpoznawane przez przeciwciało wtórne	Użyj przeciwciała wtórnego, które wykrywa natywne (niedenaturowane) immunoglobuliny. Użyj sieciowania IP, najpierw sieciując kulki białka A lub G z przeciwciałem wychwytującym za pomocą DSS

Przewodnik po wyborze kulek do immunoprecypitacji

Względne powinowactwo

Przeciwciała	Mieszanina białek A/G	Białko A	Białko G	Kappa Ig Binder	Lambda Ig Binder	Kappa/Lambda Mix*
Rabbit IgG	SA	SA
Mouse IgM	RE	SA
Mouse IgG3	SA	MSA	SA						>./tr>
Mouse IgG2b	SA	SA
Mouse IgG2a	SA	SA	SA
Mouse IgG1	MSA	MSA
Ludzkie IgM	MSA	MSA		MSA	MSA	SA
Human IgE	MSA	MSA		MSA	MSA	SA
.Ludzka IgD	MSA	MSA		MSA	MSA	SA
Ludzkie IgA	MSA	MSA		MSA	MSA	SA
Ludzkie IgG4	SA	SA	SA	MSA	MSA	SA
Human IgG3	SA		SA	MSA	MSA	SA
Ludzkie IgG2	SA	SA	SA	MSA	MSA	SA
Ludzkie IgG1	SA	SA	SA	MSA	MSA	SA
Rat IgM	RE	RE
Rat IgG2c	MSA	RE	MSA
Rat IgG2b	MSA	RE	MSA
Rat IgG2a	SA	RE	SA
Rat IgG1	MSA	RE	MSA
Rat IgG	MSA	SA	SA

Fragmenty	Protein A/G Mix	Protein A	Białko G	Kappa Ig Binder	Lambda Ig Binder	Kappa/Lambda Mix*
Human l					SA	MSA
Human k				SA		MSA
Human Fc	MSA	MSA		&
Human scFv	MSA	MSA		RE	RE	RE
Human F(ab')2	MSA	MSA	MSA	MSA	MSA	MSA	SA
Human F(ab)	MSA	MSA	MSA	MSA	MSA	SA
Kod klucza dla względnego powinowactwa białek A i G; PureProteome™ Kappa i Lambda kulki magnetyczne dla przeciwciał: SA = Silne powinowactwo; MSA = Umiarkowane/lekkie powinowactwo; RE = Wymaga oceny *Mieszanka PureProteome™ Kappa/Lambda nie jest pozycją katalogową. Wystarczy zakupić kulki Kappa i Lambda osobno i wymieszać w stosunku 1:1.