Immunodetekcja

Wygrywające webinarium westernowe

Prawdopodobnie bardziej niż jakikolwiek inny etap Western blot, warunki immunodetekcji podlegają największej liczbie zmiennych, częściowo dlatego, że etap ten zależy od rozpoznawania przeciwciało:antygen. Nasi naukowcy wiedzą, jak żmudne może być optymalizowanie parametrów immunodetekcji; dlatego opracowaliśmy podciśnieniowy system SNAP i.d.^® Protein Detection System, skracający czas blokowania, sondowania i płukania do 30 minut.

Śmiało, rozwiąż problemy - aby dowiedzieć się więcej o szybkiej immunodetekcji, kliknij tutaj.

Kliknij tematy dotyczące immunodetekcji, aby przeczytać o możliwych przyczynach i środkach zaradczych:

• Słaby sygnał
  
• No Signal
  
• Uneven Blot
  
• Speckled Background
  
• High Background
  
• Persistent Background
  
• Wysokie tło (dotyczy tylko protokołu szybkiej immunodetekcji)
  
• Wiązanie niespecyficzne
  <
• Obrazy odwrotne na filmie (białe pasma na ciemnym tle)
  
• Słaba detekcja małych białek
  
• Obecność dodatkowego pasma (pasm) lub pasma (pasm) o niewłaściwym rozmiarze
  
• Duże paski błędów w ilościowym Western Blotting

Słaby sygnał

Możliwa przyczyna	Receptura
Niewłaściwy odczynnik blokujący	Odczynnik blokujący może mieć powinowactwo do białka będącego przedmiotem zainteresowania i w ten sposób przesłaniać białko przed wykryciem. Wypróbuj inny środek blokujący i/lub zmniejsz zarówno ilość, jak i czas ekspozycji środka blokującego. Zbadaj odczynniki blokujące
. Niewystarczający czas reakcji przeciwciała	Wydłużyć czas inkubacji.
Niewystarczające wzmocnienie sygnału	Przejście z monoklonalnego na poliklonalne przeciwciało pierwotne. W przypadku przeciwciał poliklonalnych, obecność wielu epitopów na tym samym białku może generować większy sygnał. Jeśli używasz sprzężonego przeciwciała pierwotnego, przełącz się na niesprzężone przeciwciało pierwotne i przeciwciało wtórne, co zwiększy czułość wykrywania. Przeciwciała sprzężone z biotyną zapewniają większą czułość i wyższy wzmocniony sygnał w porównaniu do przeciwciał wtórnych sprzężonych z fluorochromem lub enzymem. Wyszukaj przeciwciała za pomocą naszej wyszukiwarki przeciwciał
Stężenie przeciwciała jest zbyt niskie lub przeciwciało jest nieaktywne	Stężenie przeciwciała jest zbyt niskie lub przeciwciało jest nieaktywne./td>	Wielokrotne cykle zamrażania-rozmrażania, zanieczyszczenie bakteryjne lub wielokrotne użycie roztworu przeciwciała może zmienić miano lub aktywność przeciwciała. Zwiększ stężenie przeciwciał lub przygotuj je na świeżo. W przypadku fluorescencyjnych przeciwciał drugorzędowych upewnij się, że fiolka z przeciwciałami i wszelkie podwielokrotności są chronione przed światłem.
Przeciwciało nieodpowiednie do Western blotting lub niekompatybilne z przygotowaniem komórek/tkanek./td>	Sprawdź w arkuszu danych, czy przeciwciało jest zgodne z metodą Western blotting. Jeśli nie, wybierz alternatywne przeciwciało. Niektóre przeciwciała działają najlepiej na zamrożonych skrawkach tkanek, podczas gdy inne preferują utrwalone tkanki. Szukaj przeciwciał zatwierdzonych do Western blotting
Przeterminowane odczynniki do wykrywania	Używaj świeżego substratu i przechowuj go prawidłowo. Przeterminowany substrat może zmniejszyć czułość. Zamów substraty chemiluminescencyjne
Problemy z transferem białek	Zoptymalizuj transfer białek (patrz wyżej).
Wysuszony blot w detekcji chromogenicznej	Jeśli występuje słaby kontrast przy użyciu chromogenicznego systemu wykrywania, blot mógł wyschnąć. Spróbuj ponownie zwilżyć blot w wodzie, aby zmaksymalizować kontrast.
Woda z kranu inaktywuje chromogeniczne odczynniki detekcyjne	Używaj wody Milli-Q® do przygotowania odczynników. Odwiedź nasze centrum edukacyjne "Woda do Western Blotting"
Azydek hamuje HRP	Nie używaj azydku w roztworach do blottingu.
Stężenie antygenu jest zbyt niskie	Nałóż więcej antygenu na żel przed blottingiem.

Brak sygnału

Możliwa przyczyna	Rozwiązanie
Niekompatybilne przeciwciała pierwotne i/lub wtórne	W miarę możliwości należy upewnić się, że przeciwciało pierwotne jest hodowane przeciwko sekwencji białka występującego u tego samego gatunku co próbka. Na przykład, użyj przeciwciała skierowanego przeciwko ludzkiej formie białka, jeśli mierzysz poziom białka w tkance ludzkiej. Jeśli identyczna sekwencja nie jest możliwa, określ nakładanie się sekwencji i reaktywność na http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein. Przeciwciała drugorzędowe są ukierunkowane na gatunek zwierzęcia, w którym wyhodowano przeciwciało pierwszorzędowe. Należy używać wyłącznie przeciwciał drugorzędowych, które zostały wyhodowane u innego gatunku niż gatunek gospodarza przeciwciała pierwszorzędowego i które są jak najbardziej oddalone filogenetycznie od gatunku próbki. Ponadto należy upewnić się, że klasy przeciwciał pierwotnych i wtórnych są dopasowane. Większość przeciwciał pierwotnych należy do klasy IgG i powinna być stosowana z przeciwciałem wtórnym specyficznym dla IgG. Szukaj przeciwciał pierwotnych i wtórnych
Zbyt niskie stężenie przeciwciał.br> Zbyt niskie stężenie przeciwciał	Zwiększ stężenie przeciwciał pierwotnych i wtórnych. Poszukaj przeciwciał pierwotnych i wtórnych
Inhibicja HRP	Przeciwciała znakowane HRP nie powinny być stosowane w roztworach zawierających azydek sodu.
Pierwotne przeciwciało zostało wyhodowane przeciwko natywnemu białku	Oddziel białka w żelu niedenaturującym lub użyj przeciwciała podniesionego przeciwko zdenaturowanemu antygenowi.
Odczynnik wykrywający nie jest wystarczająco czuły	Użyj bardziej czułego odczynnika wykrywającego, o bardziej odpowiednim zakresie wykrywania. Poznaj odczynniki do wykrywania Luminata™ do chemiluminescencyjnych Western blot Dostosuj czułość Western blot przy użyciu odczynników chemiluminescencyjnych Luminata do Western blot, które zapewniają szeroki zakres dynamiki wykrywania. Zamów odczynniki do detekcji Luminata™

Nierówna plama

	Możliwa przyczyna	Środek zaradczy
Odciski palców na Western blot spowodowane dotknięciem membrany bez rękawiczek lub kleszczyków.	Odciski palców, ślady zagięć lub odciski kleszczy na blot	Unikaj dotykania lub zaginania membrany; używaj rękawiczek i kleszczyków z tępą końcówką Zamów kleszczyki z tępą końcówką

Cętkowane tło

	Możliwa przyczyna	Recepta
Nakrapiane tło na Western blot spowodowane niewystarczającym płukaniem i/lub niefiltrowanym roztworem blokującym.	Agregaty w odczynniku blokującym	Filtruj roztwór odczynnika blokującego przez 0.2 µm lub 0,45 µm Millex® filtr strzykawkowy. Browse Millex® filters
Agregaty w przeciwciałach drugorzędowych sprzężonych z HRP	Filtruj roztwór przeciwciał drugorzędowych przez 0.2 µm lub 0,45 µm Millex® filtr strzykawkowy.

Wysokie tło

Ogólnie wysokie tło w Western blot	Prawdopodobna przyczyna<	Przyczyna
	Niska swoistość przeciwciała pierwotnego	Przejście z przeciwciała pierwotnego monoklonalnego na poliklonalne. Wyższa specyficzność tego ostatniego minimalizuje tło. Szukaj przeciwciał monoklonalnych i poliklonalnych
	Stężenie przeciwciała wtórnego jest zbyt wysokie	Zwiększ rozcieńczenie przeciwciała.
	Reaktywność krzyżowa przeciwciał wtórnych	Użyj przeciwciała drugorzędowego, które zostało wstępnie zaadsorbowane surowicą z gatunku docelowych komórek lub tkanek.
	Niewystarczająca ilość płukań	Zwiększ objętość i czas płukań. Zapoznaj się z podciśnieniowym systemem SNAP i.d.® do przeciągania roztworów myjących bezpośrednio przez membranę.
	Interakcje białko-białko	Używaj Tween®-20 (0.05%) w roztworach płuczących i wykrywających, aby zminimalizować interakcje białko-białko i zwiększyć stosunek sygnału do szumu.
	Immunodetekcja na membranie transferowej Immobilon®-PSQ	Zwiększ stężenie lub objętość stosowanego środka blokującego, aby skompensować większą powierzchnię membrany. Trwałe tło można zmniejszyć dodając do 0,5M NaCl i do 0,2% SDS do buforu płuczącego i wydłużając czas płukania do 2 godzin.
	Odczynniki niskiej jakości	Używaj wysokiej jakości odczynników i wody Milli-Q®. Odwiedź nasze centrum edukacyjne "Woda do Western Blotting" Przefiltruj wszystkie roztwory, w tym bufor transferowy.
	Reaktywność krzyżowa między odczynnikiem blokującym a przeciwciałem	Użyj innego odczynnika blokującego lub użyj detergentu Tween®-20 w buforze płuczącym.
	Prześwietlenie filmu	Skróć czas ekspozycji.
	Suszenie membrany podczas procesu inkubacji	Używaj objętości wystarczających do pokrycia membrany podczas inkubacji.
	Słaba jakość przeciwciał	Używaj wysokiej jakości przeciwciał oczyszczonych metodą powinowactwa. Szukaj zatwierdzonych, w 100% gwarantowanych przeciwciał
	Całkowicie opróżnij bloty przed ekspozycją.
	Odczynnik wykrywający jest zbyt czuły	Użyj mniej czułego odczynnika wykrywającego o bardziej odpowiednim zakresie wykrywania. Dowiedz się więcej o odczynnikach detekcyjnych Luminata™ do chemiluminescencyjnych Western blot

Trwałe tło

Możliwa przyczyna	Środek zaradczy
Niespecyficzne wiązanie	Użyj protokołu High Salt Wash Dodanie 0.5 M NaCl i 0.2% SDS do buforu płuczącego znacznie zmniejszyło tło na membranie Immobilon®-PSQ, która ma wysoką zdolność wiązania białek.

Wysokie tło (Odnosi się tylko do protokołu szybkiej immunodetekcji )

Możliwa przyczyna	Środek zaradczy
Membrana zwilża się podczas szybkiej immunodetekcji	Zmniejsz ilość detergentu Tween®-20 (<0.04%) detergentu w rozcieńczalniku przeciwciała. Używaj łagodniejszego mieszania podczas inkubacji. Przepłucz blot w wodzie Milli-Q® po elektrotransferze, aby usunąć wszelkie pozostałości SDS przeniesione z żelu. Pamiętaj, aby całkowicie wysuszyć blot przed rozpoczęciem jakiegokolwiek protokołu wykrywania.
Membrana została zwilżona w metanolu przed immunodetekcją	Nie zwilżaj wstępnie membrany.
Membrana nie była całkowicie sucha przed immunodetekcją	Membrana nie była całkowicie sucha przed immunodetekcją./td>	Upewnij się, że membrana jest całkowicie sucha przed rozpoczęciem procedury.

Wiązanie niespecyficzne

Możliwa przyczyna	Reagowanie
Zbyt wysokie stężenie przeciwciał pierwotnych	Zwiększyć rozcieńczenie przeciwciał pierwotnych. Rozcieńczanie pierwotnego przeciwciała zwiększa swoistość.
Zbyt wysokie stężenie przeciwciał wtórnych	Zwiększ rozcieńczenie przeciwciał wtórnych.
Zbyt wysokie stężenie antygenu	Zmniejsz ilość białka załadowanego na żel.

Odwrócone obrazy na filmie (białe pasy na ciemnym tle)

Negatywny (odwrócony) obraz ("wybielone" lub "wypalone" pasma) na filmie spowodowane nadmiarem drugorzędowego przeciwciała sprzężonego z HRP (po lewej). Detekcja została poprawiona przez zwiększenie rozcieńczenia przeciwciała wtórnego 10-krotnie (po prawej).	Możliwa przyczyna	Środek zaradczy
	Za dużo przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z HRP	Zmniejszyć stężenie drugorzędowego przeciwciała sprzężonego z HRP.

Słabe wykrywanie małych białek

Możliwa przyczyna	Środek zaradczy
Małe białka są maskowane przez duże cząsteczki blokujące, takie jak BSA	Rozważ kazeinę, środek blokujący o niskiej masie cząsteczkowej, taki jak poliwinylopirolidon (PVP), lub środek blokujący niezawierający białka Zbadanie odczynników blokujących Środki powierzchniowo czynne, takie jak Tween® i Triton® X-100 mogą wymagać minimalizacji. Unikaj zbyt długich czasów inkubacji z przeciwciałem i roztworem płuczącym.

Obecność dodatkowych pasm lub pasm o niewłaściwym rozmiarze

Możliwa przyczyna	Recepta
	Weryfikacja specyficzności przeciwciała jest kluczową częścią każdego eksperymentu Western blot. Oprócz zapoznania się z arkuszem danych przeciwciała w celu uzyskania dowodów swoistości, należy przeprowadzić własną weryfikację. Typowe sposoby oceny swoistości obejmują brak pasma (pasm) w komórkach/tkankach pozbawionych interesującego białka, oczekiwaną ekspresję w immunohistochemii i obecność podobnych pasm przy użyciu innego pierwotnego przeciwciała skierowanego na to samo białko.
Degradacja białka	Zapewnij odpowiednie stężenie inhibitora proteazy/fosfatazy w próbce i przygotuj lizat komórkowy na lodzie.
Glikozylacja białek, fosforylacja/defosforylacja, ubikwitynacja itp. Rozszczepienie białka	Różne modyfikacje potranslacyjne mogą zmienić masę cząsteczkową białka. Zbadaj opublikowaną literaturę na poparcie tego wniosku.

Duże słupki błędów w ilościowym Western Blottingu

Możliwa przyczyna	Recepta
Zmienność warunków blottingu między seriami eksperymentalnymi	Zapewnij identyczne warunki Western blottingu we wszystkich eksperymentach. Użyj tych samych partii przeciwciał dla wszystkich serii eksperymentu. Dodaj więcej powtórzeń.