Opracowanie prostego i szybkiego protokołu trawienia do przygotowywania próbek proteomicznych
Zhiyun Cao, Amber Henry, Judy Boland, Nicolas Caffarelli, Jeffrey Turner, Kevin Ray
Abstrakt
Wiarygodne i powtarzalne wyniki analiz proteomicznych z wykorzystaniem spektrometrii mas w dużym stopniu zależą od solidnego przygotowania próbki. Procesy przygotowania próbek są często uciążliwe i zazwyczaj obejmują denaturację chemiczną, redukcję i alkilację, wymianę buforu i całonocne trawienie proteazowe próbki białka. Te długotrwałe, złożone protokoły wymagają 3-4 godzin pracy laboratoryjnej, a następnie całonocnej inkubacji, potencjalnie wprowadzając zmienność wyników. Przygotowanie próbki wspomagane filtrem (FASP) i inne alternatywne protokoły mogą przyspieszyć przepływ pracy, ale wiążą się ze zwiększonymi kosztami i ograniczonym zastosowaniem. W tym badaniu zidentyfikowaliśmy warunki pozwalające na szybkie trawienie trypsyną w podwyższonych temperaturach, które dały wiarygodne, powtarzalne wyniki w czasie krótszym niż 2 godziny na szerokiej gamie podłoży.
Przebieg pracy
Rysunek 1. Porównanie protokołu prostego i szybkiego trawienia do przygotowania próbek proteomicznych z tradycyjnym trawieniem
TCEP (646547), CAA (C0267), IAA (A3221), dezoksycholan sodu (30970), Rapid Digest Buffer (składnik Rapid Digest Kit, MSKT0002), SOLu-Trypsin (EMS0004),&kwas mrówkowy (695076), albumina surowicy bydlęcej (P0914), mioglobina (M1882), filtr Microcon (MRCF0R030). K562 i CHO zostały wyprodukowane we własnym zakresie.
Wyniki: Oczyszczone białka
Trawienie mioglobiny
Rysunek 2.Wyniki trawienia oczyszczonych białek mioglobiny
Trawienie albuminy
Rysunek 3.Trawienie oczyszczonych białek
Trawienie pojedynczych białek przy użyciu tradycyjnego protokołu nocnego (O/N) lub szybkiego, z lub bez redukcji i alkilacji (R/A). Wykorzystane parametry bazy danych obejmują brak pominiętego rozszczepienia i 80% pewność dla peptydu.
Góra: Mioglobina, bez cysteiny
Dół: Albumina surowicy bydlęcej, 6% cysteiny
Szybkie trawienie poszczególnych białek dało porównywalne pokrycie sekwencji w porównaniu do trawienia nocnego. Białka o wysokiej zawartości cysteiny wymagają redukcji i alkilacji w celu wydajnego trawienia.
Wyniki: Białka złożone - CHO
W rozwiązaniu
Tradycyjny vs szybki
Przygotowywanie próbek wspomagane filtrem (FASP)
Rysunek 4.Białka złożone - białka komórek gospodarza CHO
Tradycyjne i szybkie trawienie białek wydzielanych przez jajniki chomika chińskiego (CHO), z i bez wspomaganego filtrem przygotowania próbki (FASP). Białka były denaturowane, redukowane i alkilowane w tradycyjnych trawieniach, ale nie w szybkich trawieniach. Szybkie trawienie dało podobną liczbę peptydów i białek jak tradycyjne trawienie nocne bez potrzeby denaturacji lub R/A.
Wyniki: Złożone białka - lizat K562
Lizaty komórek K562 przygotowano z użyciem SDS. Mocznik jest używany z FASP do usunięcia detergentu przed trawieniem. Białka zostały strawione przy użyciu tradycyjnej metody nocnej z R/A lub szybkiej metody bez R/A.
Obydwie metody trawienia dają podobną liczbę identyfikatorów peptydów i białek. Trawienie daje spójne wyniki w replikowanych preparatach. Zaobserwowano dobrą korelację między dwiema metodami dla zidentyfikowanych białek.
Rysunek 5.Białka złożone - lizat komórek K562
W porównaniu z tradycyjnymi protokołami, metoda szybkiego trawienia zidentyfikowała podobną liczbę peptydów i białek w złożonych mieszaninach, bez potrzeby chemicznej denaturacji lub redukcji i alkilacji. Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te sugerują, że włączenie buforu do szybkiego trawienia i podwyższonej temperatury może zmniejszyć wymagania dotyczące pracy i czasu przygotowania próbki do analiz proteomicznych za pomocą spektrometrii mas.
Wnioski
- Trawienie złożonych próbek białkowych w ciągu 2 godzin przy użyciu buforu do szybkiego trawienia i podwyższonej temperatury daje wyniki podobne do tradycyjnego trawienia nocnego
- Tradycyjne i szybkie trawienie daje podobną liczbę identyfikacji peptydów i białek oraz podobne pokrycie sekwencji
- Szybkie trawienie jest kompatybilne z redukcją i alkilacją, która może być wymagana dla białek o wysokiej zawartości cysteiny
- Redukcja i alkilacja jest opcjonalna dla złożonych próbek proteomicznych
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?