Sortowanie nanorurek węglowych i ich zastosowania biologiczne
Hyunkyu Oh, Sang-Yong Ju
Department of Chemistry, Yonsei University Seoul 120-749, Korea
Wprowadzenie
Nanorurki węglowe (CNT) cieszą się dużym zainteresowaniem od czasu ich odkrycia w 1991 roku przez Sumio Lijima1 ze względu na ich doskonałe właściwości mechaniczne, elektryczne i optyczne. Podobnie jak inne nanostruktury (np. kropki kwantowe, nanodruty), właściwości fizyczne CNT są określane przez rozmiar i strukturę atomów. CNT mają ogromny potencjał zastosowań w tranzystorach, przezroczystych foliach, emiterach podczerwieni, czujnikach, sondach skanujących, materiałach strukturalnych, katalizatorach itp.2,3 CNT produkowane seryjnie zawierają mieszaninę o różnych właściwościach fizycznych. Ponieważ wydajność zależy od tych właściwości, sortowanie tych rurek według ich właściwości fizycznych (metaliczność, chiralność, skrętność, długość itp.) ma kluczowe znaczenie dla najnowocześniejszych zastosowań.
Jednościenne nanorurki węglowe (SWNT) składają się z płynnie zwiniętego arkusza grafenu zawierającego tylko sp2 węgle. SWNT mają właściwości fizyczne zależne od kierunku wektora zwijania (lub wektora chiralnego), określanego przez parę liczb całkowitych (n, m). Jeśli n - m jest wielokrotnością 3, rura wykazuje charakter metaliczny; w przeciwnym razie jest półprzewodnikowa z przerwą pasmową około 1 eV. Półprzewodnikowe CNT mają ekscytonowe pasmo wzbronione,4 co powoduje fotoluminescencję (PL).5 PL CNT jest w przybliżeniu odwrotnie proporcjonalna do ich średnicy (dt). CNT o średnicy bliskiej 1 nm wykazują PL około 1200 nm, chociaż pozycje szczytowe PL są silnie zależne od chiralności CNT. Dostępne w handlu rurki CoMoCAT® (syntetyzowane z katalizatora bimetalicznego Co-Mo)6 (numery produktów. 704113, 724777, 775533 i 773735) wykazują PL w zakresie 930-1,450 nm w regionach bliskiej podczerwieni (NIR). Ta cecha emisji NIR jest bardzo przydatna do bioobrazowania, ponieważ podskórna głębokość penetracji PL w regionie NIR jest znacznie większa niż w przypadku widzialnych długości fal.
Covalent vs. Noncovalent Functionalization
W celu osiągnięcia biologicznej funkcjonalizacji nanorurek węglowych stosuje się dwie główne metody (funkcjonalizacja kowalencyjna i niekowalencyjna). Funkcjonalizacja kowalencyjna zapewnia nienaruszone funkcje chemiczne na nanorurkach węglowych, które mogą ściśle współpracować z powierzchnią biologiczną (pokazaną na Rysunkach 1A i 1B). Jednak kowalencyjna funkcjonalizacja zakłóca integralność π-sprzężonej sieci ścian bocznych i końców nanorurek węglowych, co wpływa na ich wewnętrzne właściwości. Karboksylacja CNT, jak widać w produkcie nr 755125, jest najpopularniejszą metodą funkcjonalizacji kowalencyjnej i jest osiągana przez utlenianie CNT za pomocą chemii karbodiimidów.7-9 Silne kwasy (np, kwas siarkowy i kwas azotowy) są stosowane do funkcjonalizacji oksydacyjnej, która przerywa π-sprzężoną sieć na nanorurkach i funkcjonalizuje nanorurki gatunkami utlenionymi (tj. kwasami karboksylowymi i fenolami), Kwasy karboksylowe i fenole).10 Pozostawia to wiele defektów i wpływa na optyczne, elektryczne i mechaniczne właściwości CNT.
Niekowalencyjna funkcjonalizacja CNT (Rysunki 1C do 1E) jest zwykle osiągana przy użyciu cząsteczek takich jak środki powierzchniowo czynne, polimery, biomolekuły i związki poliaromatyczne.10 Niekowalencyjne oddziaływanie opiera się głównie na oddziaływaniach hydrofobowych5,11 lub π-π12-14 bez jakiegokolwiek niszczenia integralności sieci π CNT. Co więcej, użyteczne właściwości wewnętrzne, takie jak właściwości optyczne, elektryczne i mechaniczne są zachowane, a rozpuszczalność jest lepsza. Jednak dynamiczna równowaga polimerów na powierzchni nanorurek może stanowić przeszkodę w niektórych zastosowaniach, takich jak wiązanie specyficzne dla celu i dostarczanie leków. Dlatego konieczne jest wykorzystanie właściwości fizykochemicznych CNT, takich jak PL i ściany boczne CNT jako nanoprzewody, jako zaawansowanych strategii dla zastosowań biologicznych.
Rysunek 1.Strategie funkcjonalizacji SWNT. Funkcjonalizacja kowalencyjna przy użyciu grupy defektów (A) i ściany bocznej SWNT (B); funkcjonalizacja niekowalencyjna przy użyciu niekowalencyjnych egzościennych środków powierzchniowo czynnych (C), niekowalencyjnych egzościennych polimerów (D) i endościennego C60 (E). Dostosowane z odnośnika 15.
Metody sortowania
Wydajność separacji CNT w oparciu o podejście niekowalencyjne silnie zależy od stopnia wiązania. Ponieważ wiązka nanorurek zawiera mieszaninę metalicznych i półprzewodnikowych rurek o różnej chiralności, ważne jest, aby najpierw wytworzyć wysoki stopień chiralności poszczególnych CNT, a następnie poprawić wydajność separacji CNT. Wiązanie nanorurek można monitorować za pomocą spektroskopii absorbancji i fotoluminescencji. Niewielkie wiązanie nanorurek powoduje przesunięcie ku czerwieni nawet o kilkadziesiąt meV od piku absorbancji nanorurek w obszarze NIR.16 Stopień wiązania jest również oceniany na podstawie intensywności piku PL spowodowanego transferem energii znalezionym w punkcie przecięcia dwóch różnych CNT, który jest proporcjonalny do wielkości wiązania CNT.17 Metodologie separacji niekowalencyjnej są wymienione w Tabeli 1.
Przykłady sortowania CNT
Dielektroforeza (DEP)
Jedną z pierwszych prób sortowania CNT według typu elektronicznego jest metoda dielektroforetyczna.18 Proces ten wykorzystuje prąd zmienny (ac) DEP, w którym metaliczne nanorurki wykazujące zarówno wysoką stałą dielektryczną, jak i dodatnią DEP są gromadzone na elektrodzie dla wysokiego przyłożonego pola elektrycznego, podczas gdy półprzewodnikowe rurki o niższej stałej dielektrycznej i ujemnej DEP pozostają w rozpuszczalniku. Jednak tylko niewielkie ilości CNT są zbierane tą metodą, a separacja następuje wyłącznie na podstawie typu elektronicznego ze względu na różnice w polaryzowalności metalicznych i półprzewodnikowych CNT.
Chromatografia jonowymienna oparta na DNA
Ta metoda separacji opiera się na SWNT owiniętych DNA, wykazujących różne oddziaływania elektrostatyczne z kolumną jonowymienną (IEX). Wokół nanorurek tworzy się stabilna beczka z 2D wiązaniem H z jednoniciowym DNA (ssDNA) owiniętym spiralnie wokół poszczególnych CNT (Rysunek 2A), odsłaniając fosforan deoksyrybozy. Uważa się, że selekcja nanorurek wynika z elektrostatycznych i elektrodynamicznych oddziaływań między nanorurkami DNA a żywicą jonowymienną.23 Czyste chiralne nanorurki zostały oddzielone tą metodą po raz pierwszy.42 Niedawny eksperyment wykazał, że ulepszony motyw strukturalny ssDNA pozwala na rozdzielenie 12 różnych chiralnych CNT o czystości 60-90% (Rysunek 2B).23 Jednak szacowana wydajność chiralnych (n, m) rurek jest bardzo niska; oczekuje się, że większość nanorurek zostanie zaadsorbowana na kolumnie jonowymiennej w stanie związanym. Główną wadą separacji SWNT za pomocą chromatografii jonowymiennej opartej na DNA jest wysoki koszt stosowanego ssDNA i kosztowny proces produkcyjny (tj. wysoki koszt kolumny IEX i jej nieunikniona wymiana spowodowana zatykaniem).
Rysunek 2.Separacja SWNT przy użyciu jednoniciowych wstążek DNA. A) Anty-równoległe nici DNA (tj. ATTTATTTATTT) owijają się wokół (8,4) SWNT utrzymywanych przez wiązania wodorowe między nićmi DNA i ππ oddziaływanie między DNA i SWNT. B) Widma absorpcyjne UV-Vis-NIR 12 oczyszczonych SWNT o różnej chiralności rozdzielonych za pomocą chromatografii kolumnowej jonowymiennej. Sortowanie każdego SWNT można poprawić, stosując różne sekwencje DNA. Dostosowane z odnośnika 23.
Ultrawirowanie w gradiencie gęstości (DGU)
DGU oddziela nanorurki na podstawie różnicy gęstości (n, m) CNT w medium gradientowym przy użyciu ultrawirowania. CNT zdyspergowane w cholanie sodu (lub soli żółciowej) wykazują różne współczynniki sedymentacji w zależności od ich średnicy, długości, typu (lub metaliczności), wiązania, a nawet ręczności.19,22,43 Metoda ta wykazuje różnorodne możliwości separacji (Tabela 1). Przykład zilustrowano na Rysunku 3, gdzie kolorowe pasma reprezentujące separację warstw pochodzą z absorpcji chiralnych CNT. Jodiksanol (produkt nr D1556), ulepszone podłoże gradientu gęstości dla DGU, umożliwia regulację gęstości od 1,32 (60%) do 1.00 g/cm3 (0%), co obejmuje zakres gęstości od skupionych (1,2-1,3 g/cm3) do zindywidualizowanych (1,0 g/cm3) nanorurek z rozproszonych próbek. Wprowadzenie kosurfaktantu, takiego jak dodecylosiarczan sodu (SDS), zwiększa selektywność określonej chiralności.19 Na przykład dziesięć czystych nanorurek o czystości od 34 do 88% zostało oddzielonych za pomocą DGU z kosurfaktantem.22 Warto zauważyć, że nanorurki o mniejszych średnicach wykazują mniejszą gęstość. NanoIntegris produkuje SWNT o określonej chiralności metodą DGU, które są dostępne w handlu (nr produktu 750522 i 750530).
Rysunek 3.Sortowanie SWNT poprzez ultrawirowanie w gradiencie gęstości (DGU). A) Po ultrawirowaniu (np. 200 000 g) przy użyciu wirnika typu swing bucket, nanorurki węglowe są sortowane według ich wyporności (tj. największą wyporność wykazywały rurki o małej średnicy) i są umieszczane w punkcie izopiknicznym w żelu gradientowym. B) Odpowiednie widma NIR warstwowych SWNT po separacji za pomocą DGU. Dostosowane z odnośnika 19.
Wielokolumnowa chromatografia żelowa (MUGEC)
W MUGEC, kilka kolumn jest połączonych pionowo w szeregu w celu uzyskania separacji chiralności na dużą skalę. Selektywna adsorpcja SWNT rozproszonych w SDS na kolumnie żelowej na bazie dekstranu allilowego (Sephacryl® S-200HR, nr produktu S200HR) pozwala na separację metaliczną i półprzewodnikową oraz separację opartą na chiralności SWNT. Ze względów termodynamicznych, 44 rurki metaliczne wykazują większą stabilność w stosunku do podłoża żelowego i są eluowane jako pierwsze, podczas gdy rurki półprzewodnikowe są preferencyjnie adsorbowane na podłożu żelowym (Rysunek 4A). Ta metoda sortowania jest również wysoce zależna od średnicy i chiralności, podobnie jak w przypadku DGU. Kolejność separacji w wielokolumnowej chromatografii żelowej pokazuje, że nanorurki o małej średnicy były adsorbowane jako pierwsze na żelu, co wskazuje na wysokie powinowactwo do podłoża dekstranowego.Rysunek 4B ilustruje rozdział 13 typów nanorurek według czystości.24 Oczekuje się, że metoda ta zapewni stosunkowo niedrogie nanorurki o czystości chiralnej, jeśli zapewniona zostanie wysoka wydajność separacji.
Rysunek 4.Separacja chiralności SWNT przy użyciu chromatografii wielokolumnowej opartej na allilodekstranie. A) Używając SDS jako pojedynczego środka powierzchniowo czynnego, zdyspergowane SWNT zostały zaadsorbowane na podłożu kolumny, a po nasyceniu rurki o pojedynczej chiralności zostały wzbogacone zgodnie z ich powinowactwem wiązania do kolumny. B) Masowa separacja iteracyjnej chromatografii kolumnowej w celu wytworzenia SWNT wzbogaconych o pojedynczą chiralność, pokazująca ich różne kolory w zależności od ich chiralności. Dostosowane z odnośnika 24.
Miareczkowanie oparte na mononukloetydzie flawiny (FMN)
Metoda ta polega na supramolekularnym, helikalnym owijaniu FMN na powierzchni nanorurek węglowych (Rysunki 5A i do 5C). Biomolekuła ta wykazuje wyraźne powinowactwo wiązania lub stałą równowagi w kierunku miareczkowania kosurfaktantu, umożliwiając (8,6) separację nanorurek do 85% czystości (Rysunek 5D).25 Ponadto, optycznie aktywna d-rybitylowa grupa fosforanowa FMN zapewniaFMN zapewnia chiralną powłokę dla równie chiralnych nanorurek, co skutkuje separacją nanorurek z enancjoselektywną skrętnością (Rysunek 5E).26 Wykorzystując wyznaczoną energię wiązania FMN w kierunku kosurfaktantu, takiego jak dodecylobenzenosiarczan sodu (SDBS) na CNT, ta metodologia separacji może zapewnić niedrogą platformę skalowania dla selektywnych CNT.
Rysunek 5.Mononukleotyd flawinowy (FMN) samoorganizuje się wokół SWNT poprzez spiralne owijanie. A) Struktura arkusza 2D FMN na ścianie bocznej SWNT. Jeden FMN tworzy poczwórne wiązania wodorowe z dwoma naprzeciwległymi FMN. B) FMN posiadający chiralną grupę d-rybitylofosforanową preferuje lewoskrętne SWNT w swoim własnym prawoskrętnym wzorze helikalnym. C) Boczne grupy fosforanowe FMN powodują dyspersję SWNT poprzez odpychanie anionowe. D) Mapowanie fotoluminescencji oddzielonych (8,6) SWNT przy użyciu strategii podwójnego miareczkowania środka powierzchniowo czynnego. E) Widmo dichroizmu kołowego skrętności enancjoselektywnie rozdzielonych SWNT przy użyciu dyspersji SWNT i FMN w rozpuszczalnikach wodnych. Dostosowane z referencji 25,26.
Bio-zastosowanie separowanych nanorurek węglowych
CNT są wykorzystywane jako nowe platformy biosensoryczne i nanoprobówki do różnych celów biologicznych. Wiele wysiłków wykorzystuje CNT jako narzędzia do terapii przeciwnowotworowej. Oczywiście chemia powierzchni, rozmiar i stopień agregacji odgrywają kluczową rolę w regulowaniu interakcji CNT z komórkami. Dlatego też techniki separacji CNT mogą dostarczyć cennych narzędzi do obrazowania i terapii nowotworów.
Jednak toksyczność była jedną z głównych obaw związanych z wykorzystaniem CNT w zastosowaniach biomedycznych. Badanie in vivo wykazało, że CNT sfunkcjonalizowane polimerem/surfaktantem wydają się być bezpieczne nawet po podaniu doustnym myszom w wysokiej dawce (do 1000 mg/kg masy ciała).45 Doniesiono, że dotchawicze podawanie zmielonych, niefunkcjonalizowanych CNT agreguje się w płucach i prowadzi do toksyczności płucnej i stanu zapalnego.46 Jednak efekt agregacji (ostra toksyczność) nie był obserwowany w przypadku fluorescencyjnych pojedynczych SWNT.47
Bioobrazowanie z wykorzystaniem CNT
Zdolność CNT do bioobrazowania opiera się na ich fluorescencji. Fluorescencja jest jedną z dróg relaksacji cząsteczek wzbudzonych światłem, które mogą być relaksowane przez kanały radiacyjne (fluorescencyjne) lub nieradiacyjne. Radiacyjna wydajność kwantowa fluorescencji nanorurek węglowych waha się od 0,1% do 20%, w zależności od rodzaju środków powierzchniowo czynnych i mediów.5,48 Ponieważ większość środków powierzchniowo czynnych nie jest biologicznie kompatybilna, konieczne jest zastosowanie biologicznie kompatybilnego lipidu, takiego jak fosfolipid-glikol polietylenowy49 w celu uzyskania minimalnej dawki nanorurek węglowych.
Po rozwiązaniu kwestii związanych z biokompatybilnością i wiązaniem nanorurek, oddzielone CNT wymagają odpowiedniego zakresu fluorescencji ze względu na silną absorpcję i rozpraszanie ludzkiej skóry w obszarze światła widzialnego. Pożądane jest wykorzystanie zakresów bliskiej podczerwieni (NIR I: 750-900 nm i NIR II: 1,0-1,4 μm),38 gdzie współczynniki absorpcji ludzkiej skóry właściwej i podskórnej wynoszą odpowiednio około 0,02 i 0,1 na mm.50 Wiadomo, że nanorurki o mniejszej średnicy mają silniejszą fotoluminescencję.51 Niedawno grupa Dai wykazała, że nanorurki wzbogacone chiralnością (np, (12,1) i (11,3) Rysunek 6A) otrzymane metodą filtracji żelowej mogą być wykorzystane do fluorescencji w zakresie bliskiej podczerwieni. Oddzielone nanorurki, których wzbudzenie i emisja wynoszą odpowiednio około 800 i 1200 nm, nie tylko zwiększają swoją fluorescencję 5-krotnie, ale także zapewniają bliskie dopasowanie do ekscytującej linii lasera NIR I przy 808 nm. Znacznie jaśniejsze nanorurki znacznie obniżają wymaganą dawkę nanorurek, 0,16 mg/kg w porównaniu do poprzedniego badania z użyciem 1,0 mg/kg.38 Rysunek 6B przedstawia obraz NIR myszy po wstrzyknięciu CNT wzbogaconych chiralnością i porównanie z narządami zidentyfikowanymi za pomocą analizy głównych składowych (PCA) (Rysunek 6C).
Rysunek 6.Obrazowanie in vivo w czasie rzeczywistym całej myszy przy użyciu półprzewodnikowych SWNT wzbogaconych chiralnością. A) Mapy PLE dla SWNT o chiralności (12,1) i (11,3). B) Obrazowanie in vivo całego ciała myszy NIR-II po wstrzyknięciu SWNT wzbogaconych chiralnością. C) Obraz analizy składowych głównych (PCA), w którym płuca, nerki i wątroba są oznaczone kolorami odpowiednio zielonym, różowym i niebieskim. Zaadaptowano z odnośnika 39.
CNT-based Targeted Drug Delivery and Cancer Therapy
Kowalencyjnie sfunkcjonalizowane CNT były głównie wykorzystywane do celowanego dostarczania in vitro leków, plazmidowego DNA lub małego interferującego RNA (siRNA) do komórek poprzez endocytozę. Strategie funkcjonalizacji kowalencyjnej do dostarczania genów wykorzystują głównie funkcjonalność aminową CNT do stabilizacji anionowych ugrupowań DNA. Rysunek 7 ilustruje różne podejścia do dostarczania leków i terapii przeciwnowotworowej na bazie CNT. Podstawowe podejścia do funkcjonalizacji ukierunkowane na interakcję z jednostkami biologicznymi to: 1) funkcjonalizacja przeciwciał, peptydów i małych interferujących RNA (siRNA); oraz 2) CNT zaprojektowane jako nośnik do dostarczania cząsteczek (lub leków). Te pierwsze mogą być wykorzystywane do dostarczania docelowych ligandów, leków chemioterapeutycznych i biomolekuł poprzez łatwą chemię kowalencyjną na surfaktancie. Te drugie wykorzystują albo chemię kowalencyjną, którą można rozszczepić na CNT, albo niekowalencyjne interakcje, takie jak interakcje van der Waalsa, między CNT a lekiem. Wyraźne odejście od tych podejść uzyskano wykorzystując funkcjonalizację hydrofobowych ścian bocznych nanorurek węglowych. Jak pokazano na Rysunku 7, aromatyczny lek, taki jak doksorubicyna, oddziałuje ze ścianami bocznymi CNT poprzez π-π stacking. CNT sfunkcjonalizowane na ściankach bocznych mogą pomieścić do 4 gramów leku na 1 gram nanorurek, dzięki dużej powierzchni CNT. Co ciekawe, w środowisku o kwaśnym pH lek ten sprzyja uwalnianiu doksorubicyny z powierzchni nanorurek, co jest odpowiednie do leczenia środowiska nowotworowego z lokalnym środowiskiem kwaśnym.
Rysunek 7.Schematyczne strategie dostarczania leków i terapii przeciwnowotworowej oparte na SWNT. Zaadaptowano z referencji 52.
Co więcej, CNT mogą być wykorzystywane bezpośrednio w terapii przeciwnowotworowej. Ponieważ fotowzbudzone nanorurki rozluźniają się uwalniając energię cieplną, zjawisko to można wykorzystać jako terapię fototermiczną. Jeśli używany jest laser o krótkim impulsie, CNT mogą działać jak nanobomby, gdy moc padająca jest poza zdolnością przewodzenia ciepła nanorurek, co jest określane jako terapia fotoakustyczna.53 Inną strategią jest generowanie ciepła z CNT za pomocą pola o częstotliwości radiowej (RF). Ponieważ pole RF o częstotliwości bliskiej 13,6 MHz ma doskonałą zdolność penetracji tkanek,54 metoda ta może przezwyciężyć problemy napotykane w terapiach fototermicznych i fotoakustycznych CNT.
Wnioski
Ostatnie postępy w sortowaniu CNT pozwalają nam uzyskać dostęp do nanorurek węglowych o wysokiej czystości. Oddzielone CNT, z ich precyzyjnie dostosowanymi właściwościami fizycznymi, mogą być następnie wykorzystywane w cennych, zaawansowanych technologicznie bioaplikacjach. Chociaż obecnie w użyciu jest niewiele przykładów takich zastosowań, odpowiednie nanorurki węglowe o określonej strukturze, typie elektronowym, chiralności, długości, skrętności itp. wykazują obiecujące wyniki w zakresie bioobrazowania, dostarczania leków i innych zastosowań związanych z biologią. Gdy potencjalna długoterminowa toksyczność nanorurek zostanie lepiej zrozumiana, dzięki połączeniu fotoluminescencji, fototermii i możliwości fotoakustycznych, CNT znajdą szerokie zastosowanie jako narzędzia do zastosowań biomedycznych, takich jak bioobrazowanie, dostarczanie leków / genów i terapia przeciwnowotworowa.
Referencje
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?