Barwniki Atto dla doskonałego obrazowania fluorescencyjnego

Aktywowane barwniki fluorescencyjne są rutynowo stosowane do znakowania białek, kwasów nukleinowych i innych biomolekuł do zastosowań w naukach przyrodniczych, w tym mikroskopii fluorescencyjnej, cytometrii przepływowej, hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ , testów wiązania receptorów i testów enzymatycznych. Barwniki Atto to seria barwników fluorescencyjnych, które spełniają krytyczne potrzeby nowoczesnych technologii fluorescencyjnych:

• Stabilność - Atto 655 i Atto 647N są fotostabilne i wysoce odporne na degradację ozonową, co czyni je idealnymi do zastosowań w mikromacierzach. Zobacz powiązany artykuł "Analyzing Properties of Fluorescent Dyes used for Labeling DNA in Microarray Experiments".
• Long Signal Lifetimes - Signal decay times of 0.6-4.1 nanoseconds allow timegate studies to reduce autofluorescence background and scattering.
• Zmniejszone tło - Kilka barwników Atto ma długość fali wzbudzenia większą niż 600 nm, co zmniejsza fluorescencję tła z próbek, rozpraszanie Rayleigha i Ramana.
• Wybór - Barwniki Atto mają silne sygnały fluorescencyjne, które obejmują widzialne i bliskie podczerwieni długości fal emisji.

Długie czasy życia sygnału barwnika Atto

Barwniki Atto wykazują dłuższe czasy życia sygnału fluorescencji (0,6-4,1 ns) w roztworze wodnym niż barwniki karbocyjaninowe lub większość autofluorescencji nieodłącznie związanej z komórkami i biomolekułami. Sygnał z barwników Atto może być mierzony przy użyciu impulsowego wzbudzenia laserowego z systemem detekcji z bramkowaniem czasowym w celu zmniejszenia zakłóceń z fluoroforów o krótszych czasach życia, autofluorescencji tła oraz rozpraszania światła Rayleigha i Ramana, poprawiając ogólną czułość.

Długie długości fali wzbudzenia redukują tło

Wykazano, że wzbudzenie laserem diodowym przy długości fali 635 nm i czerwono-absorbujące barwniki fluorescencyjne redukują autofluorescencję próbek biologicznych w stopniu wystarczającym do wykrycia poszczególnych cząsteczek antygenów i przeciwciał w próbkach ludzkiej surowicy.^1,2 Wzbudzenie w czerwonym obszarze widma zmniejsza również uszkodzenia komórek podczas pracy z żywymi komórkami.³

Wiele barwników Atto (Atto 590 i powyżej) może być wzbudzanych przy użyciu długości fali większej niż 600 nm. Użycie aktywowanych barwników Atto o długiej długości fali w połączeniu z odpowiednią długością fali wzbudzenia zmniejsza autofluorescencję spowodowaną próbką, rozpuszczalnikiem, szkłem lub podłożem polimerowym i poprawia ogólną czułość w analizie biologicznej i technikach obrazowania. Fluorescencja tła spowodowana rozpraszaniem Rayleigha i Ramana jest również znacznie zmniejszona dzięki zastosowaniu wzbudzenia o większej długości fali.

Zakres długości fal emisji od 479 do 764 nm dla fluorescencyjnej detekcji multipleksowej

Barwniki Atto mają silne sygnały fluorescencyjne, przy czym większość z nich ma wartości absorbancji molowej >100,000 i niskie nakładanie się wzbudzenia/emisji, dzięki czemu barwniki Atto są idealne do technik multipleksowych wykorzystujących widzialne i bliskie podczerwieni długości fal emisji.

Dzięki maksimom sygnału wzbudzenia w zakresie od 390 do 740 nm i dobrej separacji przesunięcia Stokesa, barwniki Atto nadają się do stosowania z dowolnym popularnym źródłem światła wzbudzającego.

Fluorescencyjna detekcja multipleksowa z wykorzystaniem barwników Atto

Barwniki Atto mogą być używane do koniugacji sond i biomolekuł w zastosowaniach multipleksowych. Wybór dwóch barwników Atto z oddzielnymi sygnałami emisji umożliwia uzyskanie wielu wyników wzbudzenia i pomiaru w jednym eksperymencie.

Fluorescencyjna detekcja multipleksowa z wykorzystaniem koniugatów przeciwciał z barwnikami Atto

Wykrywanie immunoblot białka 1 i białka 2 przy użyciu dwóch przeciwciał pierwotnych i dwóch koniugatów barwnika anty-IgG-Atto. Obrazowanie przeprowadzono sekwencyjnie przy użyciu skanera laserowego FLA-3000 Fuji®, najpierw przy długości fali wzbudzenia 532 nm z filtrem emisji 580 nm, a następnie przy długości fali wzbudzenia 633 nm z filtrem emisji 675 nm. Nakładanie obrazów zostało wykonane przy użyciu oprogramowania.

Alternatywy dla powszechnie stosowanych fluoroforów

Dzięki szerokiemu wyborowi dostępnych barwników Atto, można użyć dowolnego powszechnie stosowanego źródła światła wzbudzającego, a barwniki Atto mogą zastąpić inne barwniki fluorescencyjne powszechnie stosowane w naukach przyrodniczych.

Fluorofon	Zalecana alternatywa barwnika Atto
Alexa Fluor 488	Atto 488
FITC	Atto 488
FAM™	Atto 488
JOE™	Atto 520
TET™	.Atto 520
Alexa Fluor 532	Atto 532
HEX™	Atto 532, Atto Rho6G
TAMRA™	Atto 550
Cy3	Atto 550
Cy3.5	Atto 565
ROX™	Atto 565, Atto Rho11
Alexa Fluor 594	Atto 590, Atto 594
Texas Red®	Atto 590
Alexa Fluor 633	Atto 633, Atto Rho14
Cy5	Atto 647, Atto 647N, Atto 655
Alexa Fluor 647	Atto 647, Atto 647N, Atto 655
Cy5.5	Atto 680, Atto 700

Źródło światła	Główne linie (nm)	Zalecane barwniki Atto
Lampa łuku rtęciowego	365Zalecane barwniki Atto
Lampa łukowa rtęciowa	365, 405, 436, 546	Atto 390, Atto 425, Atto 465, Atto 550, Atto 565
Lampa łukowa rtęciowa	577	Atto 590, Atto Rho101, Atto 594; Atto Rho13, Atto 610, Atto 611x
Lampa ksenonowa	Ciągłość i szczyty >800 nm	Atto 610, Atto 620, Atto 647, Atto 647N, Atto 655, Atto 680
Lampa halogenowa	Mała emisja UV i fioletu; Większa intensywność w kierunku dłuższych fal	Atto 610, Atto 620, Atto 647, Atto 647N, Atto 655, Atto 680
Laser jonowo-argonowy	488, 514	Atto 488, Atto 520, Atto 532, Atto 550
Laser argonowo-kryptonowy	488, 514, 647, 676	Atto 520, Atto 647, Atto 647N, Atto 655, Atto 680
Laser kryptonowy	647,676	Atto 647, Atto 647N , Atto 655, Atto Oxa12, Atto 665, Atto 680, Atto 700, Atto 725, Atto 740
Laser He-Ne	633	Atto Rho14, Atto 633, Atto 647, Atto 647N
Laser Nd-NAG	532	Atto 532, Atto Rho6G, Atto 550, Atto 565, Atto Rho11, Atto Rho 12
Wspólny laser diodowy	635, 650, 670	Atto 633, Atto 647, Atto 647N, Atto 655, Atto 680

Reaktywne barwniki i koniugaty Atto

Barwniki Atto wytwarzają intensywne sygnały fluorescencyjne dzięki silnej absorbancji i wysokiej wydajności kwantowej. Barwniki są dostępne w następujących formatach:

• Bezkwasowe barwniki do wszystkich rutynowych zastosowań barwienia
• NHS-estry do stosowania w typowych protokołach koniugacji
• Maleimidy do stosowania w sprzęganiu z grupami zawierającymi tiol, takimi jak reszty cysteinowe i znaczniki tiolowe (-SH) dodawanymi podczas automatycznej syntezy
• Połączone z biotyną, streptawidyną i przeciwciałami

Atto 655, Atto 680 i Atto 700 są wygaszane przez guanozynę, tryptofan i pokrewne związki poprzez bezpośredni kontakt barwnika z czynnikiem wygaszającym i przy użyciu procesu transferu elektronów. Fluorescencyjne wygaszanie barwników przez reszty tryptofanu w białkach zostało wykorzystane do odróżnienia niezwiązanego (niefluorescencyjnego) białka od interakcji białko-przeciwciało (fluorescencyjnych).¹

	λabs	ε max	λem	ηem	τem	Numer katalogowy
Dye	nm	m-1  cm-1	nm	%	ns	Free Acid	NHS Ester	Maleimid	Azydek	Amina	Iodo-acetamid	Biotyna
Atto 390	390	24,000	479	90	3.8	89313	89204	89740	68321
Atto 425	436	45,000	484	90	3.5	56749	16805	49349	78948			28616
Atto 430LS	433	32,000	547	65	4.0	06714	56387	41882
Atto 465	453	75,000	508	55	2.2	50712	53404	55607	&
Atto 488	501	90,000	523	80	3.2	41051	41698	28562	72709	74417	74402	30574
Atto 490LS	496	40,000	661	30	2.6	06715	78362	78363	93688
Atto 495	495	80,000	527	45	2.4	16951	00379	41022	&
Atto 514	511	115,000	533	85	3.0	52595	67455	81062	44311	93728	80027	00713
Atto 520	516	110,000	538	90	3.8	70706	77810	16590	61911			01632
Atto 532	532	115,000	553	90	3.8	06699	88793	68499
Atto Rho6G	535	115,000	560	90	4.1	88821	93516	87785				94169
Atto 540Q	542	105,000				40592	61683	62453
Atto 550	554	120,000	576	80	3.2	42424	92835	30730	41986	39271		28923
Atto 565	563	120,000	592	90	3.4	75784	72464.	18507	43069.			92637
Atto Rho3B	565	120,000	592	50	1.5	93685	28743	76531				07876
Atto Rho11	571	120,000	595	80	4.0	56611	89101	51431				19096
Atto Rho12	576	120,000	601	80	4.0	44432	68761	72763				91254
Atto Thio12	579	110,000	609	15	2.0	56963		94079				87784
Atto Rho101	586	120,000	610	80	4.2	77085	50492	73522				94379
Atto 580Q	586	110,000				03722	44756	68152
Atto 590	594	120,000	624	80	3.7	70425	79636	39887				43208
Atto 594	601	120,000	627	85	3.5	08637	08741	08717	72998	61583		03927
Atto Rho13	600	120,000	625	80	3.9	16973	68538	44535				76141
Atto 610	615	150,000	634	70	3.3	78493	93259	41061				43292
Atto 612Q	615	115,000		&		04327	53988	50332
Atto 620	619	120,000	643	50	2.9	92716	67351	49728	&				72978
Atto Rho14	625	140,000	646	80	3.7	59746	61909	14397	&			76140
Atto 633	629	130,000	657	64	3.2	18620	01464	n/a	68517	73245	68652
Atto 647	645	120,000	669	20	2.3	97875	07376	41784	&
Atto 647N	644	150,000	669	65	3.4	04507	18373	05316	91000	95349	73353	93606
Atto 655	663	125,000	684	30	1.9	93711	76245	80661	11774	14918	73948	06966
Atto Oxa12	663	125,000	684	30	1.8	92606	55785	01971	&				61938
Atto 665	663	160,000	684	60	2.9	16851	04022	01407				01376
Atto 680	680	125,000	700	30	1.8	94875	75999	04971				55819
Atto 700	700	120,000	719	25	1.5	30674	16986	50611	59825	19571		73911
Atto 725	729	120,000	752	10	0.5	47156	93725	90979				69616
Atto 740	740	120,000	764	10	0.6	91394	59808	77071				50842
Atto MB2	658	100,000				75118	73499	51797			&	02934

Wygodne koniugaty barwników Atto

Dostępny jest szeroki wybór koniugatów i zestawów barwników Atto, w tym:

• Zestawy do znakowania białek
  • Atto 488 to doskonała alternatywa dla fluoresceiny i Alexa Fluor 488, wytwarzająca koniugaty o większej fotostabilności i jaśniejszej fluorescencji.
  • Atto 550 jest alternatywą dla barwników rodaminy, Cy3 i Alexa Fluor 550, oferując bardziej intensywną jasność i zwiększoną fotostabilność.
  • Atto 594 jest alternatywą dla Alexa Fluor 594 i Texas Red.
  • Atto 647N jest niezwykłym wysoce fluorescencyjnym barwnikiem, a Atto 655 jest alternatywą dla Cy5 i Alexa Fluor 647.
  • Atto 633 jest alternatywą dla Alexa Fluor 633.

• Lektyny do badań wiązania węglowodanów.

• Przeciwciała pierwotne i wtórne do bezpośrednich i pośrednich testów ELISA, immunoblottingu, immunohistochemii i innych zastosowań do identyfikacji białek.

• Biotyna i streptawidyna do koniugacji awidyna / streptawidyna / biotyna w zastosowaniach obejmujących ELISA, immunohistochemię, hybrydyzację in situ i cytometrię przepływową.

• Koniugaty niklowe NTA do bezpośredniego wykrywania rekombinowanych białek znakowanych polihistydyną.

Mikroskopia fluorescencyjna wycinka tkanki ludzkiej skóry (utrwalonej parafiną) z infekcją grzybiczą. Docelowy węglowodan chitotrioza grzybów chorobotwórczych jest specyficznie związany z lektyną z koniugatu Phytolacca americana Atto 488 (zielony). Jądra są wybarwione DAPI (niebieski). Zdjęcie wykonane przez J. Zbären, Inselspital, Bern.

Białko p38 MAPK znakowane His (500 ng - 25 ng) rozdzielono na 4-20% żelu Tris-glicynowym SDS-PAGE. Po utrwaleniu i przemyciu żel inkubowano z Ni-NTA-Atto 647N (1:1000) w ciemności. Żel przemyto, a następnie zobrazowano za pomocą skanera laserowego FLA-3000 Fuji^® ze wzbudzeniem 633 nm i filtrem emisji 675 nm dla Ni-NTA-Atto 647N (λex 647 nm, λem 669 nm). Pasmo 50 ng p38-MAPK znakowanego His jest obserwowane przy użyciu obrazowania fluorescencyjnego.

Fosfolipidy znakowane barwnikiem ATTO

Fosfolipidy są głównym budulcem błon biologicznych. Badanie błon biologicznych (np. błon wewnątrzkomórkowych żywych komórek, błon plazmatycznych) stało się głównym obszarem zainteresowania. Oferujemy serię fosfolipidów znakowanych fluorescencyjnie. Właściwości optyczne wybranej serii barwników pozwalają na ich stosowanie ze wszystkimi powszechnie stosowanymi ustawieniami filtrów wzbudzenia i emisji. Oferujemy różnorodne fosfolipidy oparte na glicerolu niosącym jeden lub dwa kwasy tłuszczowe (grupy lipofilowe) i resztę monoestrową fosforanu (grupa hydrofilowa), takie jak 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina (DPPE), 1,2-dioleilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina (DOPE), 1-palmitoilo-2-hydroksy-snglicero-3-fosfoetanoloamina (PPE) i 1,2-dimyrystoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina (DMPE). Fluorofory są kowalencyjnie połączone z hydrofilową grupą czołową fosfolipidów.

Nr produktu	Opis
< href=44039	Atto 488 DIGMA	Opis
44039	Atto 488 DPPE
93580	Atto 532 DPPE
51016	Atto 550 DPPE
40924	Atto 594 DPPE
52816	Atto 633 DPPE
05152	Atto 647N DPPE
67335	Atto 488DOPE
40692	Atto 532 DOPE
42208	Atto 550 DOPE
05676	Atto594 DOPE
90077	Atto 633 DOPE
42247	Atto 647N DOPE
54368	Atto 488 DMPE
06713	Atto 532 DMPE
42971	Atto 550 DMPE
72567	Atto 594 DMPE
55284	Atto 633 DMPE
89522	Atto 647 DMPE
51028	Atto 488 PPE
94092	Atto 532 PPE
78998	Atto 550 PPE
19504	Atto 594 PPE
56530	Atto 633 PPE
91327	Atto 647N PPE

Referencje

1. Neuweiler H, Schulz A, Vaiana AC, Smith JC, Kaul S, Wolfrum J, Sauer M. 2002. Detection of Individual p53-Autoantibodies by Using Quenched Peptide-Based Molecular Probes. Angew. Chem. Int. Ed.. 41(24):4769-4773. https://doi.org/10.1002/anie.200290044

2. Sauer M, Zander C, Müller R, Ullrich B, Drexhage K, Kaul S, Wolfrum J. 1997. Detection and identification of individual antigen molecules in human serum with pulsed semiconductor lasers. Applied Physics B: Lasers and Optics. 65(3):427-431. https://doi.org/10.1007/s003400050292

3. Sauer M, Zander C, Müller R, Ullrich B, Drexhage K, Kaul S, Wolfrum J. 1997. Detection and identification of individual antigen molecules in human serum with pulsed semiconductor lasers. Applied Physics B: Lasers and Optics. 65(3):427-431. https://doi.org/10.1007/s003400050292

4. Widengren J, Schweinberger E, Berger S, Seidel CAM. 2001. Two New Concepts to Measure Fluorescence Resonance Energy Transfer via Fluorescence Correlation Spectroscopy:  Theory and Experimental Realizations. J. Phys. Chem. A. 105(28):6851-6866. https://doi.org/10.1021/jp010301a

5. Buschmann V, Weston KD, Sauer M. 2003. Spectroscopic Study and Evaluation of Red-Absorbing Fluorescent Dyes. Bioconjugate Chem.. 14(1):195-204. https://doi.org/10.1021/bc025600x

6. Widengren J, Schwille P. 2000. Characterization of Photoinduced Isomerization and Back-Isomerization of the Cyanine Dye Cy5 by Fluorescence Correlation Spectroscopy. J. Phys. Chem. A. 104(27):6416-6428. https://doi.org/10.1021/jp000059s