miRNA (mikroRNA) Wprowadzenie

Wprowadzenie

Dojrzałe mikroRNA (miRNA) to klasa naturalnie występujących, małych niekodujących cząsteczek RNA o długości około 21-25 nukleotydów. MikroRNA są częściowo komplementarne do jednej lub więcej cząsteczek informacyjnego RNA (mRNA), a ich główną funkcją jest obniżanie ekspresji genów na różne sposoby, w tym represja translacji, rozszczepianie mRNA i deadenylacja. Zostały one po raz pierwszy opisane w 1993 roku przez Lee i współpracowników¹, a termin mikroRNA został ukuty w 2001 roku². Od tego czasu zidentyfikowano tysiące miRNA w różnych organizmach poprzez losowe klonowanie i sekwencjonowanie lub przewidywanie obliczeniowe. Baza miRBase, hostowana przez Sanger Institute, zapewnia nazewnictwo miRNA, dane sekwencyjne, adnotacje i informacje dotyczące przewidywania celów.

 Biogeneza miRNA

Rysunek 1. Ścieżki miRNA

Geny kodujące miRNA są znacznie dłuższe niż przetworzona dojrzała cząsteczka miRNA. Wiadomo, że wiele miRNA rezyduje w intronach swoich genów gospodarza pre-mRNA i dzieli ich elementy regulatorowe, pierwotny transkrypt i ma podobny profil ekspresji. W przypadku pozostałych genów miRNA, które są transkrybowane z własnych promotorów, zidentyfikowano niewiele transkryptów pierwotnych. MikroRNA są transkrybowane przez polimerazę RNA II jako duże prekursory RNA zwane pri-miRNA i składają się z czapeczki 5' i ogona poly-A³. Pre-miRNA są przetwarzane w jądrze przez kompleks mikroprocesorowy, składający się z enzymu RNazy III Drosha⁴ i białka wiążącego dwuniciowy RNA, Pasha/DGCR8⁵. Powstałe pre-miRNA mają długość około 70 nukleotydów i są składane w niedoskonałe struktury pętli macierzystych. Pre-miRNA są następnie eksportowane do cytoplazmy przez eksportynę karioferyny 5 (Exp5) i kompleks Ran-GTP⁶. Ran (białko jądrowe związane z ras) to małe białko wiążące GTP należące do nadrodziny RAS, które jest niezbędne do translokacji RNA i białek przez kompleks porów jądrowych⁷. GTPaza Ran wiąże Exp5 i tworzy jądrowy heterotrimer z pre-miRNA^6,8. Po znalezieniu się w cytoplazmie, pre-miRNA przechodzą dodatkowy etap przetwarzania przez enzym RNAse III Dicer⁹ generując miRNA, dwuniciowy RNA o długości około 22 nukleotydów. Dicer inicjuje również tworzenie kompleksu wyciszającego indukowanego RNA (RISC)^{rev. in 10}. RISC jest odpowiedzialny za wyciszanie genów obserwowane w wyniku ekspresji miRNA i interferencji RNA¹¹.

Funkcja dicerów

Dicery są dużymi białkami o masie 200 kDa zawierającymi ATPazę/helikazę RNA, domenę DUF283 (domenę o nieznanej funkcji), domenę PAZ (Piwi, Argonaut i Zwille), która może wiązać charakterystyczne dwuzasadowe nawisy 3' mi i siRNA, dwie katalityczne domeny RNazy III (RIIIa i RIIIb) oraz C-końcową domenę wiążącą dwuniciowy RNA (dsRBD). Dicer funkcjonuje jako monomer i posiada pojedyncze centrum przetwarzania z wewnątrzcząsteczkową dimeryzacją dwóch domen RNazy III. Każda domena RNazy niezależnie tnie jedną nić RNA dupleksu, generując produkty z 2-nt 3' nawisami. Oprócz wycinania miRNA z pre-miRNA, enzymy Dicer przetwarzają dsRNA na siRNA. Po rozszczepieniu Dicer, szlak miRNA jest podobny do głównych etapów interferencji RNA (RNAi) u zwierząt. W przeciwieństwie do siRNA, mikroRNA mogą kierować RISC w celu obniżenia ekspresji genów poprzez represję translacji (w oparciu o niższą komplementarność miRNA i mRNA) lub działać tak jak siRNA i pośredniczyć w rozszczepianiu mRNA. Wybór mechanizmów potranskrypcyjnych nie zależy od pochodzenia wyciszającego RNA (siRNA lub miRNA), ale od stopnia komplementarności. Jeśli miRNA jest idealnie lub prawie komplementarny do swojego celu, może specyficznie rozszczepić docelowy mRNA. Endogennie wyrażane miRNA są zwykle niedoskonale komplementarne do docelowego genu (genów) i modulują wpływ na ekspresję genów poprzez represję translacji¹².

Kompleks RISC

Kiedy Dicer rozszczepia pętlę macierzystą pre-miRNA, powstają dwie komplementarne krótkie cząsteczki RNA, ale tylko jedna jest zintegrowana z kompleksem RISC. RISC jest kompleksem rybonukleoproteinowym zawierającym członków rodziny białek Argonaute (Ago). Białka Argonaute mają aktywność endonukleazy skierowaną przeciwko niciom mRNA, które są komplementarne do związanego z nimi fragmentu miRNA. Argonauty są również częściowo odpowiedzialne za selekcję nici prowadzącej i niszczenie nici pasażerskiej. Wbudowana nić jest znana jako nić prowadząca i jest wybierana przez białko argonaute na podstawie stabilności końca 5'. Pozostała nić, znana jako nić pasażera (*), jest degradowana jako substrat kompleksu RISC. Wybór nici prowadzącej z dsRNA wydaje się opierać przede wszystkim na stabilności terminów dwóch końców dsRNA¹³. Nić o niższej stabilności parowania zasad 2-4 nt na końcu 5' dupleksu preferencyjnie łączy się z RISC i w ten sposób staje się aktywnym miRNA¹³. Po integracji z aktywnym kompleksem RISC, miRNA wywierają swoje działanie regulacyjne poprzez wiązanie się z niedoskonałymi miejscami komplementarnymi w 3' regionach nieulegających translacji (UTR) swoich docelowych mRNA. Tworzenie dwuniciowego RNA, wynikające z wiązania miRNA, prowadzi do represji translacji.

miRNA w badaniach

Chociaż pierwszy miRNA został zidentyfikowany ponad dziesięć lat temu, dopiero niedawno naukowcy zaczęli rozumieć zakres i różnorodność tych cząsteczek regulacyjnych. Coraz więcej dowodów wskazuje na to, że miRNA wykazują szereg kluczowych funkcji regulacyjnych związanych ze wzrostem, rozwojem i różnicowaniem komórek oraz są związane z wieloma różnymi chorobami ludzkimi. Kilka miRNA zostało powiązanych z rakiem^14,15 i chorobami serca¹⁶. Badania analizy ekspresji ujawniają zaburzoną ekspresję miRNA w nowotworach w porównaniu z normalnymi tkankami¹⁵. MikroRNA są zderegulowane w raku piersi, płuc i jelita grubego, a regulowane w górę w chłoniaku Burkitta i innych ludzkich chłoniakach B-komórkowych. W związku z tym ludzkie miRNA mogą być bardzo przydatne jako biomarkery, zwłaszcza w przyszłej diagnostyce raka, i szybko stają się atrakcyjnymi celami interwencji w chorobach. Oprócz ich związku z rakiem, mikroRNA odgrywają również ważną rolę w kontroli różnych aspektów funkcji i dysfunkcji serca. Obejmuje to wzrost miocytów, integralność ściany komory, kurczliwość, ekspresję genów i utrzymanie rytmu serca. Wykazano, że nieprawidłowa ekspresja miRNA jest niezbędna i wystarczająca dla wielu form chorób serca¹⁶.

Oferta produktów do badań miRNA

Jest całkiem jasne, że badania nad miRNA są bardzo obiecujące i mogą stanowić podstawę wielu najnowocześniejszych terapii medycznych jutra. Aby nadążyć za rosnącym zainteresowaniem miRNA, mocno zaangażowaliśmy się w ten szybko rozwijający się obszar badań i jesteśmy w trakcie opracowywania kompleksowego portfolio produktów dla naszych klientów, w tym izolacji, amplifikacji, profilowania i analizy funkcjonalnej miRNA. Zestaw mirPremier microRNA Isolation Kit uzupełnia już solidną linię produktów MISSION^® RNAi, która obejmuje szeroki wybór MISSION^® siRNA, MISSION^® mimetyki miRNA i produkty shRNA oraz usługi takie jak biblioteki, odczynniki do wykrywania mRNA, przeciwciała i peptydy AQUA™ do wykrywania na poziomie białka. Cały przepływ odczynników pomocniczych, w tym hodowla komórkowa, biologia komórki związki i testy, odczynniki do transfekcji i wiele innych). 

Produkty miRNA

MISSION^®./sup> Human miRNA Mimics

Biblioteka Human miRNA Mimics oparta jest na MirBase ver. 21. Dostępna w formacie biblioteki (format płytki 96-dołkowej, 0,25 nmol/dołek) oraz w pojedynczych probówkach (5 nmol). Nowatorski projekt MISSION^® miRNA mimic został funkcjonalnie przetestowany pod kątem skuteczności knockdown przeciwko naturalnym celom miRNA i zmniejsza możliwe efekty poza celem.

MISSION^® Target ID Library

.Biblioteka MISSION^® Target ID Library umożliwia bench-topową, transkryptomiczną identyfikację docelowych genów ludzkich miRNA i ncRNA. Dzięki innowacyjnemu systemowi selekcji podwójnie pozytywnej, umożliwia on szybkie badanie całego transkryptomu miRNA i ncRNA dla każdego badacza przy minimalnym nakładzie czasu, odczynników lub sprzętu.

MISSION^® 3′UTR Lenti GoClone powered by SwitchGear Genomics™

.Nawiązaliśmy współpracę z SwitchGear Genomics^™ aby zaoferować obejmującą cały genom kolekcję MISSION^® 3′UTR Lenti GoClones. Nowy system wykorzystuje wektory wirusowe do dostarczania ludzkich 3′UTR połączonych z nowym genem reporterowym RenSP firmy SwitchGear. Odczynniki LightSwitch Luciferase Assay Reagent™ zostały zaprojektowane specjalnie do użytku z RenSP i zapewniają maksymalną czułość, zakres dynamiczny i wygodę.

Referencje

1. Lee RC, Feinbaum RL, Ambros V. 1993. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75(5):843-854. https://doi.org/10.1016/0092-8674(93)90529-y

2. Ruvkun G. 2001. MOLECULAR BIOLOGY: Glimpses of a Tiny RNA World. 294(5543):797-799. https://doi.org/10.1126/science.1066315

3. Lee Y, Kim M, Han J, Yeom K, Lee S, Baek SH, Kim VN. 2004. MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II. EMBO J. 23(20):4051-4060. https://doi.org/10.1038/sj.emboj.7600385

4. Han J. 2004. The Drosha-DGCR8 complex in primary microRNA processing. Genes & Development. 18(24):3016-3027. https://doi.org/10.1101/gad.1262504

5. Denli AM, Tops BBJ, Plasterk RHA, Ketting RF, Hannon GJ. 2004. Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature. 432(7014):231-235. https://doi.org/10.1038/nature03049

6. Yi R. 2003. Exportin-5 mediates the nuclear export of pre-microRNAs and short hairpin RNAs. Genes & Development. 17(24):3011-3016. https://doi.org/10.1101/gad.1158803

7. Moore MS, Blobel G. 1993. The GTP-binding protein Ran/TC4 is required for protein import into the nucleus. Nature. 365(6447):661-663. https://doi.org/10.1038/365661a0

8. Lund E. 2004. Nuclear Export of MicroRNA Precursors. Science. 303(5654):95-98. https://doi.org/10.1126/science.1090599

9. Bernstein E, Caudy AA, Hammond SM, Hannon GJ. 2001. Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature. 409(6818):363-366. https://doi.org/10.1038/35053110

10. Hammond SM. 2005. Dicing and slicing. 579(26):5822-5829. https://doi.org/10.1016/j.febslet.2005.08.079

11. Hammond SM, Bernstein E, Beach D, Hannon GJ. 2000. An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells. Nature. 404(6775):293-296. https://doi.org/10.1038/35005107

12. Filipowicz W, Jaskiewicz L, Kolb FA, Pillai RS. 2005. Post-transcriptional gene silencing by siRNAs and miRNAs. Current Opinion in Structural Biology. 15(3):331-341. https://doi.org/10.1016/j.sbi.2005.05.006

13. Schwarz DS, Hutvágner G, Du T, Xu Z, Aronin N, Zamore PD. 2003. Asymmetry in the Assembly of the RNAi Enzyme Complex. Cell. 115(2):199-208. https://doi.org/10.1016/s0092-8674(03)00759-1

14. Croce CM. 2008. Oncogenes and Cancer. N Engl J Med. 358(5):502-511. https://doi.org/10.1056/nejmra072367

15. van Rooij E, Olson EN. 2007. MicroRNAs: powerful new regulators of heart disease and provocative therapeutic targets. J. Clin. Invest.. 117(9):2369-2376. https://doi.org/10.1172/jci33099