Przejdź do zawartości
Merck
Strona głównaZaawansowana edycja genówAktywacja genów oparta na CRISPR

Aktywacja genów oparta na CRISPR

CRISPR do edycji epigenetycznej - dCas9

Edycja epigenomu to narzędzie, w którym DNA lub histon są modyfikowane w określonych miejscach genomu za pomocą zmodyfikowanych cząsteczek. Strategia ta wymaga precyzyjnego celowania, które osiąga się poprzez zastosowanie pozbawionego nukleazy Cas9 (dCas9). Jednakże, w przeciwieństwie do edycji genomu, edycja epigenomu nie wpływa na sekwencję DNA genomu.

p300-dCas9 Induced Targeted Histone Acetylation

Acetylacja histonów, przeprowadzana przez acetylotransferazy histonów (HAT), odgrywa fundamentalną rolę w regulacji dynamiki chromatyny i regulacji transkrypcji. Znaczenie acetylacji histonów w nowotworach zostało potwierdzone klinicznie za pomocą kilku inhibitorów HDAC jako środków przeciwnowotworowych. p300/CBP jest acetylotransferazą histonową (HAT), której funkcja jest krytyczna dla regulacji ekspresji genów w komórkach ssaków. Domena HAT p300 (1284-1673) jest aktywna katalitycznie i może być połączona z nukleazami w celu ukierunkowanej edycji epigenomu.

Opracowaliśmy podejście do skutecznej ukierunkowanej acetylacji histonów przy użyciu CRISPR. Wykazaliśmy, że gRNA może z powodzeniem kierować dCas9 połączonym z domeną katalityczną p300 HAT w celu zwiększenia poziomu acetylacji histonów i endogennej ekspresji genów. Ta strategia badania funkcji acetylacji histonów w określonych loci genomowych ma ogromny potencjał badawczy i terapeutyczny.

DCas9-p300 CRISPR Gene Activator

System dCas9-p300 CRISPR Gene Activator opiera się na fuzji dCas9 z katalityczną domeną rdzeniową acetylotransferazy histonowej (HAT) ludzkiego białka p300 związanego z E1A. Podejście to zostało niezależnie zatwierdzone przez laboratorium Gersbach (Duke University) w celu aktywacji genów zarówno w proksymalnych, jak i dystalnych lokalizacjach względem miejsca rozpoczęcia transkrypcji (TSS). Podejście acetylacji histonów dCas9-p300 reprezentuje odmienny mechanizm działania w stosunku do dCas9-VP64 lub innych podobnych motywów aktywacji genów. Podczas gdy domeny aktywacyjne, takie jak VP64, pomagają rekrutować kompleksy transkrypcyjne do regionu promotora, są one na łasce stanu epigenetycznego genu i zależą od dostępności dodatkowych białek transkrypcyjnych. I odwrotnie, białko acetylotransferazy histonowej p300 otwiera autostradę transkrypcyjną, uwalniając DNA ze stanu heterochromatyny i umożliwiając ciągłą i silną ekspresję genów przez endogenną maszynerię komórkową.

Loading
Białko fuzyjne dCas9p300

Powyżej znajduje się mapa plazmidu, który wyraża białko fuzyjne dCas9p300. Plazmid ten również współeksprymuje GFP z tego samego transkryptu co dCas9p300, aby łatwo monitorować dostarczanie i ekspresję w docelowym typie komórek. Plazmid dCas9p300 może być współtransfekowany z niestandardowymi plazmidami U6-gRNA w celu aktywacji w pobliżu miejsc rozpoczęcia transkrypcji lub innych miejsc regulacyjnych. Dostępny jest plazmid kontrolny Oct4 (CRISPR17-1EA), który może być wykorzystany do pomocy w ustaleniu podejścia dCas9p300 w laboratorium. Wykazano, że ta kontrola Oct4 działa w komórkach HEK293 (rysunek poniżej). Zalecamy przetestowanie kontroli Oct4 w komórkach HEK293 wraz z każdym nowym typem komórek, który chcesz wypróbować.

OCT4 (POU5F1) jest jednym z najtrudniejszych celów do aktywacji

Octamer-binding TF 4 (Oct4, POU5F1) jest kluczowym czynnikiem transkrypcyjnym (TF), który utrzymuje pluripotencję komórek macierzystych. Odgrywa również kluczową rolę w przywracaniu pluripotencji komórkowej. Ekspresja OCT4 jest silnie wyciszona w zróżnicowanych komórkach. Aktywacja wyciszonego genu OCT4 stała się charakterystycznym wydarzeniem podczas epigenetycznego przeprogramowania w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC).

p300-dCas9 aktywował endogenną OCT4

Domena HATp300 (1284-1673) została połączona z dCas9 (D10A, H840A) w celu wygenerowania p300-dCas9. Zaprojektowano dziewięć gRNA ukierunkowanych na OCT4. Sześć z dziewięciu testowanych gRNA, wraz z p300-dCas9, spowodowało 2-krotny lub wyższy poziom transkryptu OCT4 w porównaniu do kontrolnych komórek HEK293.

Referencje

1.
Hilton IB, D'Ippolito AM, Vockley CM, Thakore PI, Crawford GE, Reddy TE, Gersbach CA. 2015. Epigenome editing by a CRISPR-Cas9-based acetyltransferase activates genes from promoters and enhancers. Nat Biotechnol. 33(5):510-517. https://doi.org/10.1038/nbt.3199
2.
Ji Q, Fischer AL, Brown CR, Eastlund ER, Dvash T, Zhong B, Gerber MA, Lyons I, Knight SW, Kreader CA. 2014. Engineered zinc-finger transcription factors activate OCT4 (POU5F1), SOX2, KLF4, c-MYC (MYC) and miR302/367. 42(10):6158-6167. https://doi.org/10.1093/nar/gku243
Zaloguj się, aby kontynuować

Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.

Nie masz konta użytkownika?