Cynk w hodowli komórkowej

Znaczenie i zastosowanie cynku w bezsurowiczych hodowlach komórek eukariotycznych, w tym hybrydoma i komórek jajnika chomika chińskiego (CHO)

Cynk, suplement pożywek bez surowicy, przydatny w produkcji biomateriałów, inżynierii tkankowej i pożywkach specjalnych

Cynk jest niezbędnym pierwiastkiem w hodowli komórkowej. Jednak klasyczne pożywki zazwyczaj nie zawierają go w swoich podstawowych formułach. Wynika to z faktu, że surowica stosowana w stężeniu od 5 do 10% zapewnia wystarczającą ilość cynku do wzrostu i przeżycia komórek. Wysiłki zmierzające do opracowania pożywek niezawierających surowicy wymagają dodania cynku do systemu hodowli komórkowej. Jednak wymóg ten niekoniecznie jest oczywisty. Niektóre pożywki, takie jak Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM), które są często używane jako podstawa do rozwoju pożywek hybrydoma bez surowicy, nie zawierają cynku w swoich podstawowych formułach. Pożywki te są jednak często uzupełniane insuliną. Insulina jest fizjologiczną cząsteczką transportującą cynk, a insuliny stosowane do uzupełniania pożywek na poziomie mg/l zawierają wystarczającą ilość cynku, aby przynajmniej częściowo wspierać komórki w hodowli.

Zakres suplementacji cynkiem w wybranej grupie klasycznych pożywek waha się od 0,7 pM w pożywce Williams E przeznaczonej do hodowli komórek wątroby do 3 nM w pożywce Ham's Nutrient Media, F-12 i jej pochodnych: F-12 Coon's (F12C) Modification; MCDB media 151 i 302 oraz Serum-Free/Protein Free Hybridoma Medium. Stężenie cynku w DMEM/Ham's Nutrient Mixture F-12 (50:50), pożywce często wykorzystywanej jako baza do opracowywania zastrzeżonych pożywek dla komórek CHO, wynosi 1,5 nM. Stężenie cynku w F-12 Kaighn's (F12K) Modification; i pożywkach MCDB 105, 110 i 153 wynosi 0,5 nM. MCDB 201 i Ham's F-10 zawierają 100 pM cynku, a podłoże MCDB 131 zawiera 1 pM cynku.

Podstawowe funkcje cynku w systemach hodowli komórkowych

Cynk jest niezbędny do życia. Znaleziono go w ponad 100 enzymach, które są zaangażowane w szeroki zakres procesów podtrzymujących życie.

• Cynk stabilizuje błony komórkowe poprzez wiązanie się z grupami sulfhydrylowymi na białkach powierzchniowych komórek.
• Cynk znajduje się w Zn, Cu dysmutazie ponadtlenkowej (SOD). Zarówno cynk, jak i miedź odgrywają również rolę w regulacji transkrypcji genu SOD. Dlatego cynk pomaga chronić komórki przed uszkodzeniem przez rodniki ponadtlenkowe.
• Kilka enzymów ma cynk jako kation koordynujący: dehydrogenaza alkoholowa, dehydrogenaza kwasu glutaminowego; anhydraza węglanowa i karboksypeptydaza. Kilka dehydrogenaz zależnych od NAD to białka cynkowe.
• Cynk jest częścią rodziny białek regulujących transkrypcję, znanych jako białka z palcem cynkowym. Odgrywa rolę w regulacji syntezy RNA.
• Enzymy metabolizujące kwasy nukleinowe, takie jak polimerazy RNA i DNA, kinaza dezoksytymidynowa i odwrotna transkryptaza wymagają cynku

.Właściwości chemiczne cynku, które czynią go użytecznym suplementem bez surowicy

Cynk jest metalem przejściowym, który w przeciwieństwie do żelaza i miedzi nie przyczynia się do stresu oksydacyjnego in vitro. Występuje w roztworach fizjologicznych jako elektrofilowy kation dwuwartościowy, który słabo wiąże się z ligandami o niskiej masie cząsteczkowej, takimi jak aminokwasy, peptydy, kwasy organiczne i fosforany. Skutecznie wiąże się z mostkami dwusiarczkowymi białek. Wewnątrzkomórkowe cząsteczki magazynujące i przenoszące cynk należą do rodziny białek metalotionein, a in vitro jest on transportowany na albuminie. Białka te są bogate w mostki dwusiarczkowe.

Wiązanie cynku z albuminą nie jest bardzo ścisłe. Gdy obecne są komórki, cynk wiąże się z mostkami sulfhydrylowymi białek błony komórkowej. Sprzyjają temu drugorzędowe i trzeciorzędowe zmiany w konformacji białek błonowych. Stwierdzono, że cynk pomaga stabilizować błony komórkowe.

Inne cząsteczki obecne in vitro mogą wpływać na wiązanie cynku z albuminą lub komórką. EDTA silnie wiąże cynk, a jego obecność może zmniejszać jego dostępność dla komórek. EDTA może zostać nieumyślnie wprowadzony do pożywki hodowlanej. Może się to zdarzyć, jeśli komórki, które zostały przetworzone za pomocą EDTA, nie zostaną odpowiednio umyte przed wprowadzeniem do pożywki hodowlanej. Środki redukujące, takie jak glutation, 2-merkaptoetanol lub DTT, gdy są obecne w pożywce, mogą zakłócać mostki dwusiarczkowe białek, powodując uwalnianie cynku.

Cynk może zostać utracony z pożywki w wyniku wytrącania. Może się to zdarzyć tylko wtedy, gdy pożywka jest poddana stresowi oksydacyjnemu. Stres oksydacyjny tworzy kilka anionów, takich jak tlenki, nadtlenki i siarczki, które tworzą osady cynku.