Kwas liponowy (tioktynowy) w hodowli komórkowej

Znaczenie i zastosowanie kwasu liponowego w hodowlach eukariotycznych bez surowicy, w tym hybrydoma i komórek jajnika chomika chińskiego (CHO)

Kwas liponowy (inaczej kwas tioktynowy), suplement pożywki bez surowicy, przydatny w biomanufacturingu; Inżynieria tkankowa i pożywki specjalistyczne

Niezwiązany z białkami kwas liponowy (inaczej kwas tioktynowy) jest rozpuszczalnym w wodzie i lipidach dwusiarczkowym kwasem tłuszczowym, który może przemieszczać się przez błonę komórkową limfocytów i fibroblastów. W aktywności kwasu liponowego pośredniczą jego atomy siarki, które biorą udział w wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych reakcjach redukcji utleniania oraz w chelatowaniu metali przejściowych.

Kwas liponowy został wprowadzony do podstawowych formuł mediów w mieszankach odżywczych Ham's Nutrient Mixtures pierwotnie opracowanych do klonalnego wzrostu komórek jajnika chomika chińskiego (CHO). Znajduje się on w mieszaninach składników odżywczych Ham's F-10, Ham's F-12; mieszaninie składników odżywczych Ham's F-12 Kaighn's Modification (F12K); pożywce Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/Ham's Nutrient Mixture F-12 (50:50); wszystkich formułach pożywek MCDB i pożywce Hybridoma Free/Protein Free Serum. Jest prawdopodobne, że kwas liponowy jest również obecny w zastrzeżonych pożywkach opracowanych na bazie pożywki podstawowej Ham's. W związku z tym kwas liponowy może być ważny w heterologicznej produkcji białek z udziałem komórek CHO i inżynierii tkankowej.

Kwas liponowy uczestniczy w wielu procesach chemicznych zarówno wewnątrz, jak i na zewnątrz komórki. To w połączeniu z jego zdolnością do przekraczania błony komórkowej sprawia, że kwas liponowy jest szczególnie ważnym składnikiem pożywek wolnych od surowicy i białek. 

Podstawowe funkcje kwasu liponowego w systemach hodowli komórkowej

Kwas liponowy (LA) jest syntetyzowany przez komórki eukariotyczne i nie jest uważany za witaminę. Synteza kwasu alfa-liponowego w systemach ssaków jest słabo poznana, ale według doniesień obejmuje oktanoiloACP, który jest wytwarzany podczas syntezy kwasów tłuszczowych i syntetazy lipoilowej, która dodaje atomy siarki. Kwas liponowy i jego zredukowana forma, kwas dihydroliponowy (DHLA), są zaangażowane w kilka aspektów metabolizmu energii komórkowej i aminokwasów, a także w obronę przed stresem oksydacyjnym i apoptozą.

Metabolizm energii i aminokwasów

Kwas liponowy jest wymagany do metabolizmu pirogronianu; półproduktu cyklu TCA, alfa-ketoglutaranu oraz aminokwasów glicyny, leucyny, izoleucyny i waliny. Związany kwas liponowy, lipoamid, jest koenzymem unikalnych enzymów E2 czterech mitochondrialnych kompleksów enzymatycznych: dihydrolipoamidowej S-acetylotransferazy (EC 2.3.1.12) dehydrogenazy pirogronianowej; dihydrolipoamidowej S- sukcynylotransferazy (2.3.1.61) kompleksu alfa-ketoglutaranu; transacylaza rozgałęzionego dihydrolipoamidu (brak numeru EC) kompleksu dehydrogenazy rozgałęzionych kwasów ketonowych; oraz aminometransferaza (EC 2.1.2.1), składnik systemu rozszczepiania glicyny.

Lipoamid jest również koenzymem składnika X występującego w kompleksach dehydrogenaz.

Mimetyk glukozy

Kwas liponowy pomaga komórkom przezwyciężyć insulinooporność wywołaną stresem oksydacyjnym. Wchłanianie glukozy do komórek jest regulowane przez rodzinę transporterów GLUT specyficznych dla heksozy. GLUT-4 jest bardzo ważnym członkiem rodziny transporterów GLUT, ponieważ jego aktywność jest regulowana przez insulinę. Insulina jest często dodawana do hodowli komórkowych o niskiej zawartości surowicy i bez surowicy. Stres oksydacyjny może indukować insulinooporność komórek poprzez zakłócanie szlaku sygnałowego insuliny, który reguluje aktywację GLUT-4. Wykazano, że kwas liponowy przezwycięża insulinooporność wywołaną stresem oksydacyjnym in vitro. W warunkach stresu oksydacyjnego kwas liponowy może zastąpić insulinę jako środek wspomagający zwiększony wychwyt glukozy za pośrednictwem transportera GLUT-4.

Funkcje przeciwutleniające

Kwas liponowy i kwas dihydroliponowy wywierają swoje działanie przeciwutleniające poprzez kilka mechanizmów. Regenerują endogenne przeciwutleniacze, usuwają metale przejściowe z reakcji redoks poprzez chelatowanie i reagują nieenzymatycznie (zmiatając) z reaktywnymi formami tlenu.

Funkcje antyoksydacyjne i antyapoptotyczne LA i DHLA są ze sobą powiązane i zależą od zdolności niezwiązanego z białkami LA/DHLA do przekraczania błon komórkowych i poddawania się zarówno enzymatycznemu, jak i nieenzymatycznemu utlenianiu i redukcji. Handelman, G. J., et.al. (1994) podali, że limfocyty i fibroblasty absorbują kwas liponowy z pożywki, redukują go do DHLA i skutecznie uwalniają do pożywki hodowlanej. Jones, W., et.al. (2002) podali, że hodowane ludzkie komórki śródbłonka absorbują LA, redukują go i uwalniają DHLA do pożywki hodowlanej. Peinado, J., et.al. (1989) podali, że wychwyt kwasu liponowego przez hepatocyty odbywał się głównie za pośrednictwem nośnika i może obejmować system wychwytu średniołańcuchowych kwasów tłuszczowych. W redukcji kwasu liponowego wewnątrz komórek pośredniczą co najmniej trzy enzymy, które łączą utlenianie NADH lub NADPH. Te trzy enzymy to mitochondrialna zależna od NADH dehydrogenaza dihydrolipoamidowa (EC 1.8.1.4) oraz cytoplazmatyczne zależne od NADPH reduktazy tioredoksyny (EC 1.8.1.9) i glutationu (EC 1.6.4.2). Ames, E. S., et.al. (1996) i Jones, W., et.al. (2002) sugerują, że reduktaza tioredoksyny może być ważniejsza dla redukcji kwasu liponowego w komórkach ssaków niż dehydrogenaza dihydrolipoamidowa. Dehydrogenaza lipoamidowa redukuje enancjomer R kwasu liponowego bardziej efektywnie niż enancjomer S, Biewenga, G. P., et.al. (1996) i Haramake, N., et.al. (1997). To, czy enancjomer S lub R kwasu liponowego jest redukowany bardziej efektywnie, redukcja zachodzi w cytoplazmie lub mitochondriach i czy ko-reduktantem jest NADH lub NADPH, zależy od konkretnego typu i stanu komórki.

Zdolność komórek do recyklingu DHLA do środowiska zewnątrzkomórkowego jest ważnym wyznacznikiem ich zdolności do stymulowania syntezy glutationu, odporności na toksyczność glutaminianu i ochrony przed peroksydacją lipidów.

Synteza glutationu

Kwas liponowy jest w stanie zwiększyć poziom glutationu w komórkach. Korzystny wpływ kwasu liponowego na poziom GSH obserwuje się przy niskich dawkach, między 25 a 100 µM. Stężenia powyżej 2 mM mogą powodować apoptozę. Kwas dihydroliponowy stymuluje syntezę glutationu poprzez poprawę wykorzystania cystyny. Po dodaniu kwasu liponowego do pożywki jest on wchłaniany, redukowany i uwalniany z powrotem do pożywki hodowlanej jako kwas dihydroliponowy (DHLA). DHLA jest w stanie zredukować cystynę do cysteiny. W przypadku wielu typów komórek dostępność cysteiny ze środowiska zewnątrzkomórkowego jest etapem ograniczającym szybkość syntezy glutationu.

Toksyczność glutaminianu

Kwas liponowy chroni komórki przed toksycznością glutaminianu. L-cysteina jest aminokwasem ograniczającym szybkość syntezy glutationu. L-cysteina może być pobierana ze środowiska zewnątrzkomórkowego zarówno jako L-cysteina, jak i L-cystyna. Te dwie formy są przenoszone do komórki przez różne mechanizmy wychwytu. L-cysteina jest transportowana głównie przez system Xc, a L-cysteina jest transportowana głównie przez system ASC. Różne typy komórek mają różną względną zależność od tych dwóch kanałów. Wrażliwość komórki na toksyczność glutaminianu może być skorelowana z jej zależnością od systemu Xc-. L-glutaminian jest konkurencyjnym inhibitorem wychwytu L-cystyny przez system Xc-, a dla komórek, które głównie wykorzystują system Xc-, wysokie stężenia glutaminianu mogą zmniejszyć szybkość syntezy glutationu. Jeśli produkcja glutationu zostanie zahamowana, może dojść do apoptozy. Kwas liponowy pomaga chronić komórki przed apoptozą indukowaną glutaminianem poprzez redukcję zewnątrzkomórkowej L-cystyny do L-cysteiny. Ten zwiększony stosunek L-cysteiny do L-cysteiny zmniejsza zależność od systemu Xc i zwiększa skuteczność systemu ASC.

Peroksydacja lipidów

Kwas dihydroliponowy chroni błony komórkowe przed peroksydacją lipidów. Po zainicjowaniu peroksydacji lipidów, jest ona samonapędzająca się i jeśli nie zostanie zatrzymana, zdestabilizuje błony komórkowe. Błonowe rodniki nadtlenkowe są przekształcane w stabilne wodoronadtlenki lipidów przez witaminę E. Redukcja rodnika nadtlenkowego lipidów generuje rodnik chromanoksylowy witaminy E. Askorbinian redukuje rodnik chromanoksylowy w celu regeneracji witaminy E i sam jest utleniany do rodnika askorbinianowego. Kwas dihydroliponowy może redukować rodnik askorbinianowy do askorbinianu. Recykling kwasu liponowego z powrotem do kwasu dihydroliponowego przez glutation i reduktazę tioredoksyny łączy ten cykl antyoksydacyjny z głównymi zasobami redukującymi komórki, glutationem i NADPH. Glutation może również bezpośrednio redukować rodnik askorbinianowy.

Naprawa białek

Reduktaza sulfotlenku metioniny (EC 1.8.4.6) redukuje S-tlenki białka-metioniny do metioniny. Równoważniki redukujące mogą pochodzić ze zredukowanej tioredoksyny lub kwasu dihydroliponowego. Ułatwia to naprawę białek, takich jak antyproteaza alfa-1, które są uszkodzone przez utlenianie.

Chemiczne atrybuty kwasu liponowego, które czynią go użytecznym suplementem bez surowicy

Kwas: C₈H₁₄O₂S₂

Masa cząsteczkowa: 206,3

Sól sodowa: C₈H₁₃NaO₂S₂

Masa cząsteczkowa: 228.3

Kwas liponowy (LA) to ośmiowęglowy kwas tłuszczowy zawierający siarki przyłączone do atomów węgla 6 i 8. Atom węgla 6 jest asymetryczny, a kwas liponowy występuje jako dwa enancjomery oznaczone jako R (d) i S (l). Naturalnie występującą formą jest R. Większość, ale nie wszystkie, dostępne na rynku kwasy liponowe są mieszaninami enancjomerów R i S. Gdy kwas liponowy jest utleniany, atomy siarczku tworzą pięcioczłonowy pierścień, ditiolan, składający się z dwóch atomów siarki i trzech atomów węgla. Jego atomy siarki i forma stereochemiczna nadają większość właściwości, które nadają kwasowi liponowemu jego aktywność chemiczną i biochemiczną. Atomy siarki LA łatwo ulegają redukcji i utlenieniu. Zredukowaną formą kwasu liponowego jest ditiol zwany kwasem dihydroliponowym (DHLA). Para redoks LA/DHLA może wchodzić w interakcje z szeroką gamą reaktywnych form tlenu, innymi przeciwutleniaczami i związkami tiolowymi.

Niezwiązany z białkami kwas liponowy jest rozpuszczalnym w wodzie i lipidach kwasem tłuszczowym. Jego rozpuszczalność w wodzie jest kontrolowana przez grupę karboksylową. Szkielet oktanowy jest hydrofobowy. Ograniczona rozpuszczalność w wodzie i hydrofobowość kwasu liponowego wpływają na jego stabilność i użyteczność w systemach hodowli komórkowych. Czynniki wpływające na dostępność kwasu liponowego do wykorzystania przez komórki w hodowli obejmują jego możliwą utratę podczas przechowywania w niskich temperaturach, jego filtrowalność i kompleksy, które tworzy.

Żelazo i miedź

Interakcje LA i DHLA z żelazem i miedzią pośredniczą w prooksydacyjnym i antyoksydacyjnym działaniu kwasu liponowego opartym na metalach przejściowych. Cu (I) i Fe (II) promują tworzenie rodników hydroksylowych poprzez reakcje Fentona. Kwas dihydroliponowy (DHLA) chelatuje Cu (II) i tworzy stabilny kompleks poniżej pH 6. W fizjologicznym pH kompleks ten ulega destabilizacji. W tej zdestabilizowanej formie Cu (II) może zostać zredukowana do Cu (I) przez DHLA. DHLA promuje również tworzenie rodników hydroksylowych poprzez chelatowanie Fe (III) i redukcję do Fe (II). W konsekwencji DHLA jest pro-utleniaczem in vitro gdy obecna jest chelatowalna miedź lub żelazo. Kwas liponowy może chelatować Cu (II) i Fe (II) i powstrzymywać te metale przed katalizowaniem tworzenia rodników hydroksylowych.

Gdy żelazo lub miedź są obecne w hodowli komórkowej, wpływ kwasu liponowego na ochronę komórek zależy w pewnym stopniu od komórek. Ponieważ zdrowe komórki mają tendencję do utrzymywania kwasu liponowego w zredukowanej formie, istnieje możliwość, że miedź i żelazo będą miały działanie prooksydacyjne, gdy będą dostępne.

Działanie zmiataczy rodników

Kwas liponowy i kwas dihydroliponowy zmiatają szeroki zakres rodników i utleniaczy in vitro. Zarówno kwas liponowy, jak i DHLA mogą zmiatać rodniki hydroksylowe, kwas podchlorawy, kwas nadtlenoazotowy i tlen singletowy. Ponadto DHLA może zmiatać nadtlenek i wodne rodniki nadtlenkowe. Nadtlenek wodoru nie jest zmiatany przez żadną z form kwasu liponowego.

Produkty kwasu liponowego, które zwiększają wzrost komórek Hybridoma, komórek jajnika chomika chińskiego (CHO) i innych komórek eukariotycznych ssaków w hodowlach bez surowicy.