Rozwiązywanie problemów związanych ze śmiercią komórek w hodowli komórkowej

• Śmierć komórki: an Overview
• Accessing and Troubleshooting Cell Death
• Related Products

Śmierć komórki: przegląd

Nie ma chyba nic bardziej frustrującego dla hodowcy komórek niż wyjęcie szalki z inkubatora i odkrycie, że jest ona pełna martwych komórek. Dotarcie do sedna problemu może być bardzo trudne i czasochłonne, ale dzięki staranności i właściwemu prowadzeniu dokumentacji można zdiagnozować i uniknąć śmierci komórek w hodowli.

Śmierć komórek występuje głównie w dwóch formach: pasywnej i zaprogramowanej. Pasywna śmierć komórki lub martwica jest procesem niezależnym od ATP, który wynika z nagłego i silnego stresu środowiskowego, który prowadzi do obrzęku komórek, a ostatecznie do ich lizy. Z kolei zaprogramowana śmierć komórki jest zależna od ATP. Jedna z form - apoptoza - może być wyzwalana zewnętrznie lub wewnętrznie i prowadzi do kurczenia się komórek, zwiększonego stężenia cytozolowego Ca²⁺ i pękania błony. Inną formą zaprogramowanej śmierci komórki -Autofagia to proces, który normalnie promuje przetrwanie komórek poprzez degradację i recykling składników komórkowych poprzez system lizosomalny komórki. Jednak w ekstremalnych warunkach stresu autofagia może prowadzić do śmierci komórki i charakteryzuje się obecnością pęcherzyka, który obejmuje mitochondria, retikulum endoplazmatyczne i rybosomy, a następnie dostarcza je do układu lizosomalnego. Ostatnie badania sugerują, że apoptoza i nekroza to dwie skrajności spośród aż dziesięciu lub więcej różnych form śmierci komórkowej i że istnieje znaczna ilość przesłuchów między tymi dwoma procesami.

Rysunek 1. Podwójne barwienie żywych/umarłych komórek.

So Many Ways to Go: A Cell Death Glossary

Anoikis: apoptoza w przylegających komórkach, która występuje z powodu utraty interakcji macierzy.  Może być głównym mechanizmem supresji nowotworów.

Apoptoza zewnątrzpochodna: zaprogramowana śmierć komórki indukowana przez sygnały zewnątrzkomórkowe, które rozpoczynają się od ligacji receptorów transmembranowych, w tym FAS

Apoptoza wewnątrzpochodna: zaprogramowana śmierć komórki, która może, ale nie musi być zależna od kaspaz, charakteryzująca się zmienionym potencjałem błony mitochondrialnej

Autofagiczna śmierć komórki: cytoplazmatyczna wakuolizacja z bezkrytycznym katabolizmem zawartości cytoplazmatycznej

Ferroptoza: zależna od żelaza, nieapoptotyczna, oksydacyjna śmierć komórki, wyzwalana przez wychwyt cysteiny

Nekroptoza: zaprogramowana forma nekrozy, charakteryzująca się sygnalizacją TNFR1 poprzez RIP1, gdy kaspaza-8 jest hamowana

Nekroza: przedwczesna śmierć komórki, często wynikająca z infekcji lub urazu

Parthanatos: wyczerpanie ATP i NAD+ przez nadmierną aktywność polimerazy

Partial demolition/cornification: trwała modyfikacja struktury i funkcji komórki, zwykle zależna od kaspaz.Przykłady obejmują enukleację erytrocytów, tworzenie włókien soczewki i keratynizację komórek skóry.

Pyroptosis: apoptoza za pośrednictwem kaspazy-1 obserwowana w warunkach zapalnych - odpowiedzialna za zanik komórek T w HIV/AIDS

Secondary necrosis: martwica występująca jako konsekwencja apoptozy, często obserwowana w hodowli komórkowej

Accessing and Troubleshooting Cell Death

.Dokładne badanie mikroskopowe naczyń hodowlanych może ujawnić oczywistą śmierć komórkową charakteryzującą się wrastaniem komórek, pęcherzami i szczątkami składającymi się częściowo z "duchów" komórek lub pozostałości błonowych. W przypadku bardziej subtelnych przypadków, istnieje wiele testów dostępnych do oceny śmierci komórek w kulturach. Perhaps the most accessible of these is the trypan blue exclusion assay that is based on the principle that healthy cells with intact membranes will exclude the dye, and is quickly performed on detached or suspension cells by&hemacytometru.Testy żywotności mogą być używane do rozróżniania i ilościowego określania żywych komórek. Testy te oceniają żywotność komórek poprzez pomiar funkcji komórkowych, takich jak aktywność enzymów, produkcja ATP, funkcja błony plazmatycznej i adhezja komórek.

Rysunek 2. Liczenie komórek przy użyciu hemocytometru i błękitu trypanu.

Tabela 1. Najczęstsze przyczyny śmierci komórek i rozwiązania pozwalające utrzymać żywotność kultur

Przyczyna	Rozwiązanie
Brak/niewiele żywych komórek po rozmrożeniu z hodowli
Kultura wyjściowa była niskiej jakości	Sprawdź, czy kultura wyjściowa użyta do wygenerowania materiału wyjściowego została prawidłowo zidentyfikowana, jest zdrowa, wolna od zanieczyszczeń mikrobiologicznych i znajduje się w późnej fazie logarytmicznego wzrostu (ale nie jest w 100% konfluentna). Komórki należy zbierać delikatnie, aby zapobiec ich uszkodzeniu.
Zapas był przechowywany nieprawidłowo	Zapas powinien być przechowywany w temperaturze poniżej -130 °C, najlepiej w ciekłym azocie, aby zapewnić maksymalną żywotność. Przechowywanie w fazie gazowej nad ciekłym azotem jest lepsze niż przechowywanie w samej cieczy ze względu na ryzyko eksplozji fiolki podczas rozmrażania, jeśli ciekły azot wyciekł do fiolki.
Zapas został rozmrożony nieprawidłowo	Postępuj zgodnie z protokołem zalecanym przez dostawcę podczas rozmrażania komórek. Ogólnie rzecz biorąc, komórki powinny być rozmrażane szybko. Należy używać wstępnie ogrzanego podłoża. Usuń pożywkę zawierającą krioprotektant tak szybko, jak to możliwe, aby zapobiec zmniejszeniu żywotności. Z komórkami należy obchodzić się ostrożnie. Nie worteksować ani nie wirować z dużą prędkością, ponieważ komórki są szczególnie podatne na uszkodzenia po kriokonserwacji.
Niedostateczna przyczepność komórek po rozmrożeniu lub pasażowaniu	Lista możliwych przyczyn odłączenia komórek znajduje się na stronie tutaj
Śmierć komórki w uprzednio zdrowej hodowli
Komórki były pasażowane zbyt wiele razy	Uzyskaj nowy zasób komórek, które były subkulturowane mniej razy.
Wahania temperatury w inkubatorze	Ręcznie sprawdź temperaturę w inkubatorze za pomocą niezależnego termometru. Ponieważ nawet kilka minut wysokiej temperatury może prowadzić do śmierci komórek, należy rejestrować temperaturę w czasie.
CO2 jest zanieczyszczony składnikami cytotoksycznymi	Używaj CO2  zaklasyfikowanego do hodowli komórkowych.
Poziomy CO2  nie odpowiadają wymaganiom systemu buforowania opartego na wodorowęglanach stosowanego podłoża, co prowadzi do nieodpowiedniej kontroli pH<	Upewnij się, że poziomy CO2  w inkubatorze odpowiadają wymaganiom systemu buforowania. Ogólnie rzecz biorąc, im wyższy poziom wodorowęglanu w buforze, tym większe stężenie CO2 jest potrzebne.
Skażenie drobnoustrojami	Zobacz Zanieczyszczenie komórek aby zapoznać się z obszerną listą sposobów zapobiegania i eliminowania zanieczyszczenia mikrobiologicznego. Należy pamiętać, że chociaż winne mogą być grzyby, wirusy i wiele rodzajów bakterii, skażenie mykoplazmą rzadko powoduje śmierć komórek.
Narażenie hodowli na światło fluorescencyjne powoduje, że wrażliwe na światło składniki pożywki (ryboflawina, tryptofan i HEPES) są przekształcane w cytotoksyczne wolne rodniki i H2O2	Przechowuj komórki i pożywki w ciemności z dala od światła fluorescencyjnego.
Komórki stały się zbyt zagęszczone	Śmierć komórek następuje, gdy hodowle stają się przepełnione. Przeprowadź komórki późno w fazie logarytmicznego wzrostu; nie pozwól, aby konfluencja przekroczyła 80%.
Podłoża, surowica, bufory itp. są niskiej jakości lub nieprawidłowo sformułowane.	Odrzuć obecne odczynniki i użyj nowych partii. Jeśli po użyciu nowych odczynników nastąpi śmierć komórek, należy zidentyfikować podejrzane partie. Przetestuj wszystkie nowe partie odczynników w kulturze przed wprowadzeniem ich do cennych lub niezastąpionych kultur.

Powiązane produkty

Media kulturowe	Trypsyna	Fetal Bovine Serum (FBS)	.Antybiotyki
Kolby hodowlane	.Authenticated Cell Lines	Pipette Tips.	Filtracja sterylna
Pipetory	Scepter™ 3.0 Automated Cell Counter	Mycoplasma Detection	/PL/plTesty żywotności i proliferacji komórek
Hemocytometr	Trypan Blue Exclusion Assay	MilliSentials™ Aliquoting Pipette Controller.	MilliSentials™ Lab Labeling System

Referencje

1. Krampe B, Al-Rubeai M. 2010. Cell death in mammalian cell culture: molecular mechanisms and cell line engineering strategies. Cytotechnology. 62(3):175-188. https://doi.org/10.1007/s10616-010-9274-0

2. Cummings BS, Wills LP, Schnellmann RG. 2012. Measurement of Cell Death in Mammalian Cells. Current Protocols in Pharmacology. 56(1):12.8.1-12.8.24. https://doi.org/10.1002/0471141755.ph1208s56

3. Méry B, Guy J, Vallard A, Espenel S, Ardail D, Rodriguez-Lafrasse C, Rancoule C, Magné N. 2017. In Vitro Cell Death Determination for Drug Discovery: A Landscape Review of Real Issues. Journal of Cell Death. 10117967071769125. https://doi.org/10.1177/1179670717691251

4. Fundamental Techniques in Cell Culture: Laboratory Handbook. . 3rd Edition. ECACC and Sigma Aldrich®

5. ATCC Animal Cell Culture Guide: Tips and Techniques for Continuous Cell Lines..

6. Ryan, JA.. Corning Guide for Identifying and Correcting Common Cell Growth Problems..

7. Cryogenic Storage of Animal Cells. ATCC. Tech Bulletin No. 3..

8. Primary Cell Culture. Sigma Aldrich®.