Rozwiązywanie problemów związanych ze słabym wzrostem komórek
Wzrost komórek: Przegląd
Zapewnienie odpowiedniego wzrostu komórek jest kluczowym elementem zbierania dokładnych danych z hodowli komórkowych. Komórki mogą być hodowane w zawiesinie lub jako monowarstwa, która jest przymocowana do naczynie do hodowli, takie jak kolba, szalka lub płytka wielodołkowa. Metoda hodowli jest określana przez endogenny fenotyp komórek i tkankę pochodzenia - tak więc komórki pochodzące z krwi zwykle rosną w zawiesinie, podczas gdy te pochodzące z tkanek stałych zwykle rosną w monowarstwach. Możliwa jest również hodowla mieszanej populacji, która zawiera zarówno komórki przyłączone, jak i fenotypy w zawiesinie.
Rysunek 1.Fazy wzrostu komórek
W przypadku komórek, które rosną jako jednowarstwowe, konfluencję definiuje się jako procent powierzchni naczynia hodowlanego, który wydaje się być pokryty warstwą komórek podczas obserwacji mikroskopowej. Na przykład, 50% konfluencji oznacza, że połowa powierzchni naczynia hodowlanego, kolby itp. jest pokryta komórkami. W przypadku komórek w zawiesinie, postęp wzrostu jest zwykle mierzony na podstawie zalecanej gęstości komórek dla danej linii lub typu - ale "konfluencja" może być oceniana na podstawie rosnącego zmętnienia i stabilnego koloru pożywki.
Wzrost komórek w hodowli generalnie występuje w czterech fazach, które po przedstawieniu na wykresie jako logarytm liczby komórek w czasie generują krzywą sigmoidalną (w kształcie litery S), chociaż ilość czasu spędzonego w każdej fazie różni się w zależności od linii komórkowych i kultur.
Faza opóźnienia - Komórki aklimatyzują się do warunków hodowli i nie dzielą się podczas tej fazy. Przyłączenie komórek następuje zazwyczaj w ciągu 24 godzin od rozpoczęcia hodowli. Całkowita długość tej fazy zależy od fazy wzrostu i gęstości wysiewu komórek, które zostały użyte do rozpoczęcia hodowli.
Log (logarytmiczna) faza wzrostu - Komórki aktywnie dzielą się podczas tej fazy i jest to najlepszy czas na ocenę wzrostu populacji, a także na ogólne gromadzenie danych. Późna faza logarytmiczna to najlepszy czas na pasażowanie (subkulturę) komórek, zanim przeludnienie może doprowadzić do stresu komórkowego.
Faza plateau (stacjonarna) - Wzrost komórek w tej fazie spowalnia, gdy komórki zbliżają się do 100% konfluencji, a mniej niż jedna dziesiąta komórek znajduje się w aktywnym cyklu komórkowym. Komórki są najbardziej podatne na uszkodzenia w tej fazie; dlatego konieczna jest uważna obserwacja, aby upewnić się, że komórki są pasażowane przed lub na początku tej fazy.
Faza spadku - Jako naturalna część cyklu komórkowego, populacja żywych komórek zmniejsza się, ponieważ w tej fazie dominuje śmierć komórek.
Dokładne liczenie komórek ma ogromne znaczenie przy ocenie wzrostu komórek w kulturach, ponieważ błędne liczenie może prowadzić do błędnych wniosków na temat zdrowia komórek. Liczbę komórek można określić za pomocą hemocytometru. Jednakże, Zautomatyzowane liczniki komórek które wykorzystują zasadę Coultera, w której komórki przepływają jedna po drugiej przez otwór w czujniku elektrycznym, zapewniają najdokładniejsze zliczanie komórek.
Rysunek 2.Ręczny automatyczny licznik komórek Scepter™ 3.0.
Ogólne wskazówki i techniki zapobiegania i eliminowania problemów ze wzrostem komórek
Oprócz przestrzegania dobrych praktyk sterylności w celu zapobiegania skażeniu mikrobiologicznemu i chemicznemu, kluczem do wczesnego diagnozowania i leczenia problemów ze wzrostem komórek jest częsta obserwacja hodowli i szczegółowe prowadzenie dokumentacji. Ważne jest również, aby rozważyć, czy najbardziej skutecznym sposobem jest szczegółowe i czasochłonne poszukiwanie winowajcy (winowajców) słabego wzrostu komórek, czy też lepiej jest po prostu zacząć od nowa ze wszystkimi nowymi odczynnikami, zapasami i materiałami eksploatacyjnymi.
Obserwuj z uwagą
Aby rozwiązać problem wzrostu komórek, należy najpierw zdać sobie sprawę z jego istnienia. Wiele problemów ze wzrostem jest subtelnych, dlatego konieczna jest regularna, szczegółowa obserwacja nie tylko niektórych, ale wszystkich naczyń hodowlanych w eksperymencie. Szybka ocena pod mikroskopem może nie być wystarczająca; wiele specyficznych wzorców wzrostu nie będzie widocznych dopóki komórki nie zostaną utrwalone i wybarwione. Regularnie sprawdzaj pożywki i inne odczynniki w poszukiwaniu zanieczyszczeń.
Zapisuj z dokładnością
Próbując zdiagnozować i rozwiązać problemy związane ze słabym wzrostem komórek, posiadanie dobrych notatek na temat wszystkich aspektów hodowli może zaoszczędzić czas, pieniądze i unikalnie zmodyfikowane komórki, takie jak linie knockout. Na przykład, normalizacja gęstości komórek i rejestrowanie liczby pasaży komórek wyjściowych jest niezbędne, aby wiedzieć, czy komórki wyjściowe mogą być źródłem problemu. Podobnie, zanim dojdzie się do wniosku, że winna jest konkretna partia pożywki, należy najpierw upewnić się, które naczynia hodowlane otrzymały tę partię.
Ważne informacje, na które należy zwrócić uwagę, obejmują źródło, dowód tożsamości i braku zanieczyszczenia, numer pasażu, gęstość komórek oraz protokoły zamrażania i przechowywania wszystkich fiolek podstawowych. Należy również odnotować składniki (i stężenia), numery partii i daty pierwszego otwarcia/użycia wszystkich użytych odczynników. Należy również odnotować numery partii wszystkich naczyń hodowlanych. Szczegółowe protokoły dla wszystkich aspektów hodowli komórek powinny być ustandaryzowane i przestrzegane. Niezbędne jest dokładne i szczegółowe oznakowanie wszystkich fiolek i naczyń hodowlanych. Należy zwracać uwagę na drobne szczegóły, takie jak czas czyszczenia i serwisowania inkubatorów, czas wymiany zbiorników CO2, czas ostatniej kontroli pomieszczenia hodowlanego pod kątem obecności mykoplazmy oraz odnotowywać wszelkie nietypowe zdarzenia.
Know when to Cut Your Losses
Czasem znalezienie dokładnego źródła problemu nie jest tak ważne, jak jego naprawienie, dlatego też bardziej opłacalne i efektywne czasowo może być skorygowanie wielu potencjalnych przyczyn słabego wzrostu jednocześnie, niż próba wyizolowania dokładnego problemu. Na przykład, sensowne może być rozpoczęcie od nowa z nową fiolką z komórkami i wszystkimi nowymi pożywkami, surowicami, buforami itp. niż próbowanie nowych partii każdego z nich niezależnie, aż do odkrycia winowajcy.
Najważniejsze wydarzenia
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?