Protokół hodowli komórkowej 10: Badanie komórek pod kątem zanieczyszczenia mykoplazmą za pomocą barwienia DNA metodą Hoechsta

ECACC Laboratory Handbook 4th Edition

Aim

Metody barwienia DNA, takie jak barwienie pośrednie Hoechst , są szybkie, a wyniki są dostępne w ciągu 72 godzin, co wypada korzystnie w porównaniu z 4 tygodniami w przypadku barwienia pośredniego Hoechst .nbsp;wykrywanie mykoplazmy przez izolację kultury. Barwienie Linie komórkowe bezpośrednio z barwnikiem DNA mogą dostarczyć wyniki w ciągu 24 godzin, jednak przy znacznie zmniejszonej czułości (~10⁶ jtk/ml). Można to poprawić poprzez współhodowle testowanej linii komórkowej w obecności wskaźnikowej linii komórkowej, takiej jak Vero. Ten etap wzbogacania daje czułość 100 jtk/ml hodowli i jest preferowaną metodą stosowaną przez ECACC. Etap ten poprawia również czułość poprzez zwiększenie powierzchni, na której może przylegać mykoplazma. Podobnie jak w przypadku wykrywania przez hodowlę, metody barwienia DNA są odpowiednie do wykrywania mykoplazmy z hodowli komórkowych lub odczynników do hodowli komórkowych.

Materiały

• Podłoża do hodowli komórkowych: wstępnie ogrzane do odpowiedniej temperatury (patrz arkusz danych linii komórkowej ECACC dla właściwej pożywki i temperatury).)
• metanol (322415)
• kwas octowy lodowaty (A6283)
• Roztwór barwiący Hoechst 33342 (B2261)
• Komórki wskaźnikowe np.g. komórki Vero (84113001)
  - Mycoplasma hyorhinis NCTC10130 i
  - Mycoplasma orale NCTC 10112

Sprzęt

.
• Środki ochrony osobistej (sterylne rękawiczki, fartuch laboratoryjny, przyłbica ochronna)
• Łaźnia wodna ustawiona na 37 °C
• Szafa bezpieczeństwa mikrobiologicznego o odpowiednim poziomie hermetyczności
• CO₂ Inkubator ustawiony na 37 °C
• Mikroskop (Epi-Fluorescencja UV.)
• Płytki do hodowli tkanek
• Wielodołkowe 12-dołkowe
• Szkiełka mikroskopowe i szkiełka nakrywkowe 13 mm
• Folia aluminiowa

Procedura

1. Umieścić sterylne szkiełka nakrywkowe w naczyniach/płytkach do hodowli tkankowej, np. 12-dołkowych.
2. Zaszczepić 2 ml komórek wskaźnikowych do przygotowanych naczyń, np. 2 x 10⁴ komórek Vero na studzienkę 12-dołkowej płytki.
3. Inkubować w temperaturze 37°C w 5% CO₂ przez 2-24 godziny, aby umożliwić komórkom przyleganie do szkiełek nakrywkowych.
4. Przenieść dołączone testowe linie komórkowe do zawiesiny za pomocą skrobaka do komórek. Zawieszone linie komórkowe mogą być testowane bezpośrednio.
5. Usuń 1 ml supernatantu hodowli z duplikatów dołków i dodaj 1 ml próbki testowej do każdego z nich. Zaszczepić 2 dołki 100 jtk każdego pozytywnego organizmu kontrolnego.
6. Pozostawić zduplikowane dołki hodowli tkankowej bez zaszczepienia jako kontrole negatywne.
7. Inkubować naczynia w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez 3-5 dni.
8. Po 3-5 dniach utrwalić komórki na szkiełku nakrywkowym, dodając co najmniej 2 ml świeżo przygotowanego utrwalacza Carnoya (1:3 lodowaty kwas octowy: absolutny metanol) do każdego naczynia i pozostawić na 3 minuty. Następnie zdekantować do butelki na odpady toksyczne. Powtórzyć jeszcze raz. Dodać co najmniej 2 ml barwnika Hoechst 0,4 μg/nl. Pozostawić na 3 minuty w osłonie przed bezpośrednim światłem, np. przykrywając folią aluminiową.
9. Zużyty i niewykorzystany barwnik zdekantować do pojemnika na odpady toksyczne.
10. Dodać 1 kroplę mountantu do wstępnie oznakowanego szkiełka mikroskopowego i umieścić szkiełko nakrywkowe (stroną z komórkami w dół) na szkiełku.
11. Przykryj szkiełko folią aluminiową i pozostaw na co najmniej 15 minut w temperaturze 37°C lub 30 minut w temperaturze pokojowej.
12. Obserwuj szkiełko pod epi-fluorescencją UV przy 100x.

Kryteria prawidłowego wyniku

Kontrole negatywne nie wykazują dowodów zakażenia mykoplazmą; kontrole pozytywne wykazują dowody zakażenia mykoplazmą; komórki Vero wyraźnie widoczne jako fluoryzujące jądra.

Kryteria dla wyniku pozytywnego

Próbki zakażone mykoplazmą są widoczne jako fluoryzujące jądra plus fluorescencja pozajądrowa DNA mykoplazmy (małe ziarniaki lub włókna).

Kryteria dla wyniku negatywnego

Niezainfekowane próbki są widoczne jako fluoryzujące jądra na ciemnym tle. Nie powinno być żadnych dowodów na obecność mykoplazmy, tj. pozajądrowej fluorescencji DNA mykoplazmy.

Uwagi

1. Barwniki DNA, takie jak barwnik Hoechst, wiążą się specyficznie z DNA. We wszystkich hodowlach jądra komórkowe będą fluoryzować. Teoretycznie niezanieczyszczone hodowle będą wykazywać tylko fluorescencyjne jądra, podczas gdy hodowle mykoplazmowe zawierają małe ziarniaki lub włókna, które mogą, ale nie muszą być adsorbowane na komórkach (Rysunek 11). Należy jednak pamiętać, że wszelkie obce DNA będzie również fluoryzować, np. szczątki komórek - co czasami jest mylone z zanieczyszczeniem mykoplazmą.
2. Barwnik Hoechst jest toksyczny i należy się z nim obchodzić i wyrzucać go ostrożnie.
3. W niektórych przypadkach wyniki mogą być trudne do interpretacji z następujących powodów:
   - Zanieczyszczenie bakteryjne/drożdżakowe/grzybicze
   - Zbyt dużo zanieczyszczeń w tle (jak w przypadku linii komórkowych hybrydoma)
   - Uszkodzone jądra, ponieważ wszystkie komórki są martwe
   . - Zbyt mała liczba lub brak żywych komórek
4. Chociaż niniejsza procedura zaleca stosowanie kontroli pozytywnych, może to niekoniecznie być wykonalne lub pożądane w placówce hodowli komórkowej o ograniczonych zasobach. Jeśli mają być stosowane kontrole pozytywne, należy to zrobić w oddzielnym laboratorium od głównego ośrodka hodowli tkanek. Jeśli kontrole pozytywne nie są stosowane, zdecydowanie zaleca się okresowe testowanie linii komórkowych przez niezależne laboratorium badawcze.
5. ECACC zaleca, aby próbki były badane na obecność mykoplazmy przy użyciu co najmniej dwóch metod wykrywania (np. pośredniego barwienia DNA i izolacji kultury) w celu uzyskania bardziej wiarygodnych wyników. Wynika to z różnej czułości wykrywania metod dla różnych gatunków mykoplazmy.

ECACC oferuje usługę testowania mykoplazmy, w której dostępne są trzy różne metody wykrywania, tj. PCR, pośrednie barwienie DNA i izolacja kultury.