Usuwanie i odtwarzanie błon Western Blotting

Western blotting jest powszechnie stosowaną techniką badania funkcji i lokalizacji białek. Zazwyczaj próbki białek są rozdzielane przez SDS-PAGE i przenoszone na nitrocelulozę lub PVDF membranę, która jest następnie sondowana specyficznymi przeciwciałami. W przeciwieństwie do technologii opartych na kwasach nukleinowych, które pozwalają na ponowne wykorzystanie Southern i Northern blots, ponowne wykorzystanie Western blots jest trudne.

Odklejanie i ponowne sondowanie Western blot ma kilka zalet:

1. Zachowanie próbek, które są drogie lub dostępne tylko w ograniczonych ilościach;
2. Analiza danego blotu przy użyciu kilku różnych przeciwciał, np. przeciwciał specyficznych dla podtypu lub izoformy;
3. Reanaliza wyników anomalii i potwierdzenie za pomocą tego samego lub innego przeciwciała;
4. Korygowanie błędów w inkubacji z niewłaściwym przeciwciałem;
5. Oszczędność kosztów odczynników i czasu dzięki ponownemu użyciu tego samego blotu.

Opublikowano wiele protokołów usuwania przeciwciał z Western blot, w tym te, które wykorzystują niskie pH, ciepło i detergent oraz środki chaotropowe. Poniżej przedstawiono trzy zalecane protokoły. Pierwszy ma zastosowanie do każdego chemiluminescencyjnego systemu substratów i wykorzystuje kombinację detergentu i ciepła do uwolnienia przeciwciał. Drugi jest powszechnie stosowany w aplikacjach, w których przeciwciała muszą być oddzielone od antygenu i wykorzystuje niskie pH do zmiany struktury przeciwciała w taki sposób, że miejsce wiązania nie jest już aktywne.

Trzeci protokół wykorzystuje ReBlot™ Plus Western Blot Recycling Kit, który został specjalnie opracowany do usuwania przeciwciał z membran Western blot. Zalety tego podejścia obejmują

• Unikanie zapachu związanego z β-merkaptoetanolem.
• Przetwarzanie w temperaturze pokojowej.
• Usuwanie przeciwciał w ciągu 15 minut.

Żadna z tych metod nie usunie kolorowych osadów generowanych przez chromogeniczne systemy detekcji (np, BCIP, 4CN, DAB i TMB). Jednak nadal możliwe jest analizowanie blotu za pomocą innego przeciwciała specyficznego dla innego białka docelowego.

Zwykle protokoły te powinny być stosowane wyłącznie do celów jakościowych, chyba że ustalono, że usuwanie nie wpływa ilościowo na dany antygen. W zależności od metody i rodzaju zastosowanej membrany, wiele antygenów wytrzyma co najmniej 5 cykli usuwania. Należy jednak wziąć pod uwagę, że podczas każdego cyklu strippingu zostaną usunięte małe porcje białek unieruchomionych na błonie. Gdy kilka antygenów ma być wykrywanych sekwencyjnie, zaleca się rozpoczęcie od antygenów, które występują w mniejszej ilości lub dają mniejszy sygnał.

Oto kilka dodatkowych zaleceń podczas planowania eksperymentu Western blot z jedną lub więcej rundami usuwania przeciwciał.

• Membrany PVDF są bardziej wytrzymałe niż nitroceluloza i dlatego są zalecane dla każdego protokołu obejmującego usuwanie przeciwciał.
• Suszenie membran PVDF natychmiast po przeniesieniu z żelu SDS-PAGE poprawia wiązanie białek z membraną i jest szczególnie zalecane, gdy planowane jest wielokrotne usuwanie przeciwciał. Suche membrany PVDF muszą być ponownie zwilżone alkoholem przed pierwszą rundą immunodetekcji.
• Wykryj najpierw antygeny o niskim powinowactwie.
• Używaj przeciwciał o niskim powinowactwie przed przeciwciałami o wysokim powinowactwie.
• Ważne: Chociaż suszenie blotu PVDF jest zalecane natychmiast po przeniesieniu, blot nie powinien być pozostawiony do wyschnięcia pomiędzy rundami immunodetekcji. Wszelkie pozostałości cząsteczek przeciwciał trwale zwiążą się z membraną, jeśli pozwoli się jej wyschnąć.

Protokół 1 Odpędzanie za pomocą ciepła i detergentu

.Wymagany sprzęt i rozwiązania

• Standardowy blot lub paski blot, na nitrocelulozie lub membranie PVDF.
• Roztwory blokujące.
• Roztwór do usuwania: 100 mM 2-merkaptoetanol (M3148), 2% (w/v) SDS (L3771), 62.5 mM Tris-HCl (T6666), pH 6.7.
• Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS): 10 mM fosforan sodu, pH 7,2, 0,9% (w/v) NaCl.
• Płytka, wystarczająco duża, aby pomieścić membranę.
• Dodatnie i ujemne kontrole usuwania.

Procedura

1. W wyciągu umieścić blot w roztworze do strippingu i inkubować z mieszaniem przez 30 minut w temperaturze 50 °C.
2. Umieść blot w buforze i mieszaj przez 10 minut. Powtórzyć czynność ze świeżym buforem.
3. Opcjonalnie:Powtórzyć początkowy protokół wykrywania (pomijając etap pierwotnego przeciwciała), aby upewnić się, że przeciwciała zostały inaktywowane lub usunięte z membrany.
4. Umieść blot w buforze i mieszaj przez 10 minut.
5. Przejdź do etapu blokowania dla następnej rundy immunodetekcji.

Protokół 2 Usuwanie przez niskie pH

.Wymagany sprzęt i rozwiązania

• Standardowy blot lub paski blot, na nitrocelulozie lub membranie PVDF.
• Roztwory blokujące.
• Roztwór stripujący: 25 mM glicyna-HCl (G2879), pH 2,1% (w/v) SDS (L3771).
• Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS): 10 mM fosforan sodu, pH 7,2, 0,9% (w/v) NaCl.
• Płytka taca, wystarczająco duża, aby pomieścić membranę.
• Pozytywne i negatywne kontrole strippingu.

Procedura

1. Umieść blot w roztworze do strippingu i mieszaj przez 30 minut.
2. Umieść blot w buforze i mieszaj przez 10 minut. Powtórzyć z użyciem świeżego buforu.
3. Przejść do etapu blokowania dla następnej rundy immunodetekcji.

Protokół 3 Usuwanie przeciwciał za pomocą ReBlot™ Plus Western Blot Recycling Kit

Re-Blot Plus Mild Antibody Stripping Solution daje dobre wyniki zarówno na membranach nitrocelulozowych, jak i PVDF. Jednakże, roztwór do usuwania przeciwciał Re-Blot Plus Strong Antibody Stripping Solution będzie działał lepiej, gdy membrany o wysokim sygnale mają zostać usunięte lub gdy obróbka Re-Blot Plus Mild nie jest wystarczająca.

Wymagany sprzęt i rozwiązania

• Standardowy blot lub paski blotów, na nitrocelulozie lub membranie PVDF.
• Roztwory blokujące.
• Plastikowa folia do przechowywania blotów, które nie zostaną natychmiast usunięte.
• Zestaw ReBlot™ Plus
• Woda destylowana do rozcieńczania odczynników.
• Płytka, wystarczająco duża, aby pomieścić membranę.
• Kontrole dodatnie i ujemne.

Procedura

Uwaga: Bloty lub pojedyncze paski, które mają być ponownie użyte, powinny być przygotowane do strippingu natychmiast po ich pierwszym użyciu. Jeśli usuwanie nie może być wykonane od razu, membrany można owinąć w folię i przechowywać wilgotne w PBS w temperaturze 4°C.

1. Napełnij plastikową tackę odpowiednią ilością 1X roztworu do usuwania przeciwciał (dostarczonego w zestawie).
2. Używając pęsety lub kleszczyków, zanurz blot lub paski blot w roztworze do usuwania przeciwciał. Inkubować z delikatnym mieszaniem przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
3. Napełnić czystą plastikową tackę taką samą ilością buforu blokującego. Konwencjonalne bufory blokujące, takie jak 20 mM Tris HCl, pH 8,0; 150 mM NaCl; 0,1% TweenR-20; 5% suchego mleka lub podobne są odpowiednie.
4. Płucz bloty dwa razy po 5 minut buforem blokującym.
5. Blot jest teraz gotowy do reprobingu z przeciwciałami.

.

Referencje

1. Lioubin MN, Myles GM, Carlberg K, Bowtell D, Rohrschneider LR. 1994. Shc, Grb2, Sos1, and a 150-kilodalton tyrosine-phosphorylated protein form complexes with Fms in hematopoietic cells.. Mol. Cell. Biol.. 14(9):5682-5691. https://doi.org/10.1128/mcb.14.9.5682

2. Legocki RP, Verma DPS. 1981. Multiple immunoreplica technique: Screening for specific proteins with a series of different antibodies using one polyacrylamide gel. Analytical Biochemistry. 111(2):385-392. https://doi.org/10.1016/0003-2697(81)90577-7

3. Harlow E, Lane D. 1988. A Laboratory Manual. 579. New York: Cold Spring Harbor Laboratory.

4. Kaufmann SH, Ewing CM, Shaper JH. 1987. The erasable Western blot. Analytical Biochemistry. 161(1):89-95. https://doi.org/10.1016/0003-2697(87)90656-7

5. Yeung Y, Stanley ER. 2009. A solution for stripping antibodies from polyvinylidene fluoride immunoblots for multiple reprobing. Analytical Biochemistry. 389(1):89-91. https://doi.org/10.1016/j.ab.2009.03.017