Liza komórek i ekstrakcja białek do Western Blotting

Wszystkie etapy ekstrakcji białek z komórek lub tkanek (świeżych lub mrożonych) muszą być wykonywane w temperaturze 2-8 °C. Poniżej przedstawiono skład jednego powszechnie stosowanego buforu do lizy, który jest używany do przygotowywania próbek białek. Odwiedź stronę Calculators, aby zapoznać się z listą przepisów na bufory i inne roztwory Western blotting.

Bufor RIPA do ekstrakcji białek gotowy do użycia (Nr produktu.R0278)

• NaCl (S3014) 150mM
  
• Triton X-100 (T8787) 1%
  
• Dezoksycholan sodu (D6750) 0.5%
  
• SDS (74255) 0.1%
  
• Tris-HCl (T1503) pH 8.0, 50 mM

Inhibitory proteaz - nie trać białek podczas przygotowywania próbek

Kroki protokołu ekstrakcji białek

1. Odrzuć pożywkę w naczyniach hodowlanych z komórkami i przemyj komórki za pomocą lodowatego PBS.
   
2. Odrzuć PBS, dodaj lodowaty bufor do lizy.
   
3. Zeskrob komórki za pomocą zimnego plastikowego skrobaka do komórek. Zebrać komórki do probówek mikrowirówkowych.
   
4. Ogazować zawartość w probówkach mikrowirówkowych przez 30 minut w temperaturze 4°C.
   
5. Wirować probówki z prędkością 16 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4°C. Zebrać supernatant do świeżej probówki i umieścić na lodzie.

Ekstrakcja białek z komórek w zawiesinie

1. Wiruj zawiesinę komórek z prędkością 2,000 x g przez 5-7 min w temperaturze 4 °C. Komórki są zbierane na dnie probówki, odrzucić supernatant.
   
2. Do osadu komórek dodać lodowato zimny PBS i przemyć komórki przez wirowanie z prędkością 2,000 x g przez 5-7 min w temperaturze 4 °C.
   
3. Dodać lodowato zimny bufor lizujący do osadu komórek. Mieszać zawartość w probówkach mikrowirówki przez 30 minut w temperaturze 4°C.
   
4. Wirować probówki z prędkością 16 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4°C. Zebrać supernatant do świeżej probówki i umieścić na lodzie. Odrzucić osad.

Ekstrakcja białek z tkanek

1. Dysekcjonuj interesującą tkankę na lodzie. Przenieś tkankę do okrągłodennych probówek mikrowirówkowych i zamroź przez zanurzenie w ciekłym azocie.
   
2. Do 5 mg tkanki dodaj 300 µL lodowatego buforu lizującego i homogenizuj za pomocą homogenizatora elektrycznego. Dodaj dodatkowe 300-600 µL buforu lizującego podczas homogenizacji.
   
3. Agituj zawartość przez 2 godziny w temperaturze 4°C.
   
4. Wiruj probówki z prędkością 16 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4°C. Zbierz supernatant do świeżej probówki i umieść w lodzie. Odrzuć osad.

Normalizacja całkowitego stężenia białka w próbkach

1. Pobierz niewielką objętość lizatu w celu przeprowadzenia testu szacowania stężenia białka.
2. Określ stężenie białka nieznanych próbek przez porównanie z wzorcami, upewniając się, że wzorzec jest rozcieńczony w tym samym buforze co nieznane próbki. Oszacowanie stężenia białek można przeprowadzić przy użyciu odczynnika do oznaczania białek Coomassie (nr produktu.27813), test BCA, absorbancja przy 280 nm.
3. Przenieść odpowiednią objętość lizatów do probówek mikrowirówki, tak aby wszystkie próbki zawierały takie samo całkowite stężenie białka.
   
4. Dodaj odpowiednią ilość lodowatego buforu do lizy, aby wszystkie lizaty miały taką samą objętość.

Wymieszaj próbki z buforem ładującym Laemmli

Poniżej podano skład buforu ładującego wymaganego do przygotowania próbek do elektroforezy.

2X bufor ładujący Laemmli:

• Błękit bromofenolowy (Nr produktu.B5525) 0,004%
• 2-merkaptoetanol 10%
• Glicerol (Nr produktu G5516) 20%
• SDS (Nr produktu 74255) 4%
• Tris-HCl (Nr produktu T1503) 0,125 M

1. Do objętości lizatu komórkowego dodać taką samą objętość buforu obciążającego.
   
2. Powyższą mieszaninę gotować w temperaturze 95 °C przez 5 minut. Wirować z prędkością 16 000 x g przez 5 minut.
   
3. Próbki te mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C lub mogą być użyte do elektroforezy żelowej.