Test enzymatyczny: Lakaza (EC 1.10.3.2)

Lakaza (EC 1.10.3.2) jest miedziowym enzymem, który utlenia różne rodzaje fenoli i podobnych związków aromatycznych amin aromatycznych z redukcją tlenu cząsteczkowego do wody, dlatego jest stosowana jako biokatalizator. Spektrofotometryczne metody oznaczania aktywności lakazy opierają się na tworzeniu się produktów wynikających z reakcji enzymatycznych i nieuniknionych kolejnych reakcji chemicznych.¹

1. Cel

Standaryzacja procedury enzymatycznego oznaczania aktywności lakazy

2. Zakres

Zakres niniejszej procedury obejmuje wszystkie produkty, dla których określono aktywność lakazy.

3. Definicje

Jedna jednostka wytworzy DA530nm 0,001 na minutę przy pH 6,5 w temperaturze 30 °C w 3 ml objętości reakcyjnej przy użyciu syringaldazyny jako substratu.

4. Dyskusja

Syringaldazyna + O₂   ^Laccase   > Utleniona Syringaldazyna + 2H₂O.

5. Obowiązki

Personel służb analitycznych jest odpowiedzialny za przestrzeganie niniejszego protokołu zgodnie z jego treścią.

6. Bezpieczeństwo

Zwrócić uwagę na karty charakterystyki substancji niebezpiecznych (SDS) w celu zapoznania się z zagrożeniami i odpowiednimi środkami ostrożności.

7. Procedura

7.1 WARUNKI:
T = 30 °C, pH = 6,5, A_530nm, droga światła = 1 cm

7.2 METODA:
Ciągłe spektrofotometryczne oznaczanie szybkości

7.3 ODCZYNNIKI:

7.3.1    100 mM bufor fosforanu potasu, pH 6.5 w 30 °C (Bufor)
(Przygotować 100 ml w wodzie dejonizowanej przy użyciu fosforanu potasu, jednozasadowego, bezwodnego, numer produktu P-5379. Dostosować do pH 6,5 w 30 °C za pomocą 1 M KOH.)

7.3.2    0.216 mM Syringaldazine Solution (SYR)
(Przygotuj 3 mL w absolutnym metanolu używając Syringaldazine, numer produktu S7896.)

7.3.3    Laccase Enzyme Solution (Laccase)
(Bezpośrednio przed użyciem przygotować roztwór zawierający 25-50 jednostek/ml Laccase w zimnej wodzie dejonizowanej).)

7.4 METODA TESTOWA
Odmierzyć pipetą następujące odczynniki do odpowiednich fiolek (w mililitrach):

	Test	Puste
Woda dejonizowana (Odczynnik 7.3.2)	-------	0.50
Bufor (Reagent 7.3.2)	2.20	2.20
Laccase (Reagent 7.3.2)	0.50	-------

Wyrównać do 30 ° C. Monitorować A530nm aż do uzyskania stałej wartości za pomocą odpowiednio termostatowanego spektrofotometru.

	Test	Blank
SYR	0.30	0.30

Mieszać przez odwrócenie i rejestrować wzrost A530nm przez około 10 minut. Uzyskać DA530nm/min. przy użyciu maksymalnej szybkości liniowej zarówno dla testu, jak i ślepej próby.

7.5 OBLICZENIA

Units/ml enzyme =	ΔA530nm Próbka = A530nm/min Test - A530nm/min Blank) (df)
	(0.001)(0.5)

df = współczynnik rozcieńczenia
0,001 = zmiana A530nm/min na jednostkę lakazy przy pH 6,5 w temperaturze 30oC w 3 ml mieszaniny reakcyjnej
0,5 = objętość (w mililitrach) użytego enzymu

7.5.2.4	Units/mg solid =	jednostki/mL enzymu
		mg solid/mL enzymu

7.6 KOŃCOWE STĘŻENIE ANALIZY:
W mieszaninie reakcyjnej o objętości 3,00 ml końcowe stężenia wynoszą 73 mM fosforanu potasu, 0,02 mM syringaldazyny, 10% metanolu i 12,5 do 25,0 jednostek lakazy.

8. Zatwierdzenie

	Nazwa Druku	Nazwa Znaku	Tytuł	Nazwa znaku	Tytuł	Data
Przygotowane przez:	Gene McNaughton	Originator	09/02/03
Approved by:	David Lintz	Przełożony	09/03/03
Zatwierdzone przez:	Jeff D. Heiland	Jeff D. Heiland	Quality Assurance	09/03/03

Referencje

1. Sheikhi F, Roayaei Ardakani M, Enayatizamir N, Rodriguez-Couto S. 2012. The Determination of Assay for Laccase of Bacillus subtilis WPI with Two Classes of Chemical Compounds as Substrates. Indian J Microbiol. 52(4):701-707. https://doi.org/10.1007/s12088-012-0298-3

2. Ride J. 1980. The effect of induced lignification on the resistance of wheat cell walls to fungal degradation. Physiological Plant Pathology. 16(2):187-196. https://doi.org/10.1016/0048-4059(80)90033-8