Rozdzielanie antybiotyków tetracyklinowych metodą HPLC z odwróconymi fazami przy użyciu kolumn Discovery

Reporter EU Volume 14

Carmen T. Santasania, David S. Bell

Reporter EU Volume 16

[email protected], [email protected] [email protected]

Na rynku znajduje się obecnie ponad 100 antybiotyków, a wiele innych jest w fazie opracowywania. Oporność na antybiotyki stanowi poważny problem (1,2): antybiotyk, którego wprowadzenie na rynek zajmuje dekadę, może wywołać oporność w ciągu kilku miesięcy od jego wprowadzenia do praktyki klinicznej (3). Częstotliwość występowania oporności u bakterii i liczba leków, na które są one oporne, rośnie. Dlatego tak ważne jest monitorowanie poziomu antybiotyków podawanych ludziom i zwierzętom.

HPLC jest potężnym narzędziem do izolacji i ilościowego oznaczania antybiotyków. W tym zastosowaniu pięć antybiotyków tetracyklinowych (rysunek A) analizowano metodą HPLC przy użyciu kolumn Discovery C18, Discovery C8 i Discovery RP-AmideC16. Antybiotyki tetracyklinowe mają szerokie spektrum działania, są stosunkowo bezpieczne i skuteczne w zwalczaniu wielu infekcji wywołanych przez bakterie Gram-ujemne i Gram-dodatnie (4,5).

Rysunek A. Struktury antybiotyków tetracyklinowych

Rozdzielenia chromatograficzne przeprowadzono w systemie Waters Alliance HPLC. Wszystkie iniekcje zostały wykonane przez autosampler. Do monitorowania absorbancji UV próbek przy 260 nm wykorzystano detektor UV Waters 2487 o podwójnej długości fali. Kolumny HPLC z fazą odwróconą Discovery C18, Discovery C8 i Discovery RP-AmideC16 o średnicy 15 cm x 4,6 mm ID były używane bez kolumn ochronnych i filtrów. Cząstki wypełnienia we wszystkich kolumnach miały średnicę 5 μm.

Doksycyklina, minocyklina, tetracyklina, chlortetracyklina i oksytetracyklina zostały rozpuszczone w 25 mM KH₂PO₄ buforze, pH 3.

Pięć antybiotyków tetracyklinowych rozdzielono za pomocą elucji gradientowej. Temperatura kolumny była kontrolowana na poziomie 35°C. Ciśnienie w kolumnie wynosiło poniżej 1050 psi we wszystkich przypadkach. Szczegółowe warunki dla każdej analizy przedstawiono wraz z odpowiednim chromatogramem.

Rozdzielanie pięciu tetracyklin zilustrowano na rysunkach B, C i D. Minocyklina i oksytetracyklina będą koeluować z kolumny C18, ale są bardzo dobrze rozdzielane przez kolumny RP-AmideC16 i C8 (rysunki C i D). Kolumna Discovery RP-AmideC16 zapewnia najlepszą rozdzielczość minocykliny i oksytetracykliny. Tło wokół pików chlortetracykliny i doksycykliny jest spowodowane zanieczyszczeniami w próbkach. Należy zauważyć, że ilości analitów na kolumnie różniły się między rysunkami B, C i D.

Rysunek B. Antybiotyki tetracyklinowe na odkrywczej kolumnie C18 HPLC (504955)

Rysunek C. Antybiotyki tetracyklinowe na kolumnie HPLC Discovery RP-AmideC16 (505013)

Rysunek D. Antybiotyki tetracyklinowe na kolumnie HPLC Discovery C8 (59353-U)

Zdolność fazy RP-AmideC16 do rozdzielania minocykliny i oksytetracykliny można wytłumaczyć wiązaniem wodorowym między funkcyjnością amidową fazy i funkcyjnością hydroksylową oksytetracykliny. Takie różnice w selektywności pokazują zalety stosowania kolumny amidowej do trudnego rozdzielania.

Badanie to wykazało, że mieszaniny antybiotyków tetracyklinowych można rozdzielić za pomocą HPLC z odwróconymi fazami, przy użyciu kolumn Discovery C18, Discovery C8 i Discovery RP-AmideC16. Z wyjątkiem koelucji tetracyklin minocykliny i oksytetracykliny na kolumnie Discovery C18, uzyskano doskonałą rozdzielczość w każdym rozdziale.

Referencje

1. Levy SB. 1998. Multidrug Resistance ? A Sign of the Times. N Engl J Med. 338(19):1376-1378. https://doi.org/10.1056/nejm199805073381909

2. Levy SB. 1992. The Antibiotic Paradox. https://doi.org/10.1007/978-1-4899-6042-9

3. Steven J. 1996. Chem. & Indus. . News. 2

4. Fedeniuk RW, Shand PJ. 1998. Theory and methodology of antibiotic extraction from biomatrices. Journal of Chromatography A. 812(1-2):3-15. https://doi.org/10.1016/s0021-9673(98)00119-8

5. N.H Booth LM. 1988 . Tetracyclines in Veterinary Pharmacology and Therapeutics Iowa State University Press .