Strategie rozwoju metod chiralnych dla HPLC
Abstrakt
Ogólne badania przesiewowe w celu zapewnienia szybkich rozwiązań w zakresie opracowywania metod chiralnych, niezależnie od tego, czy są one potrzebne do rutynowych zastosowań analitycznych, analizy śladowej, LC/MS czy preparatywnej LC, stają się coraz ważniejsze. W tym artykule proste narzędzia przesiewowe są używane z chiralnymi fazami stacjonarnymi opartymi na makrocyklicznych glikopeptydach w celu wygenerowania solidnych metod dla szerokiego zakresu zastosowań.
Czytaj więcej
Chiralna HPLC
.Zmiana strategii odkrywania leków w przemyśle farmaceutycznym zaowocowała wcześniejszym badaniem generalnie różnych aktywności biologicznych dla enancjomerów chiralnych cząsteczek leków. Liczba chiralnych cząsteczek przechodzących przez proces odkrywania ogromnie wzrosła w ciągu ostatnich kilku lat; stały się one również coraz bardziej zróżnicowane, więc podejście do opracowywania metod chiralnych musiało obejmować tylko te chiralne fazy stacjonarne (CSP), które oferują najszerszy możliwy zakres zastosowań do szybkiego i wydajnego przesiewania.
W ciągu ostatnich 25 lat lub więcej opracowano kilkaset CSP, z których około 110 jest dostępnych w handlu. Poprzez wiązanie lub powlekanie selektora chiralnego - małej cząsteczki chiralnej lub większego polimeru, takiego jak białko - na krzemionce, można indukować różne siły oddziaływania dla dwóch enancjomerów. Fazy celulozowa i amylosowa były jednymi z najwcześniejszych i najszerszych CSP, które zostały opracowane i są oparte na naturalnych chiralnych polimerach, powlekanych (lub wiązanych, jak w 2 fazach) na krzemionce; jedna z zaawansowanych technologii separacji' (Astec, obecnie część Sigma-Aldrich/Supelco) nowych produktów, kolumna PCAP ™ również wykorzystuje technologię polimerową w celu zapewnienia selektywności chiralnej w wielu typach faz ruchomych.
W połowie lat 90-tych XX wieku firma Astec opracowała nową gamę CSP opartą na wiązaniu chemicznym makrocyklicznych glikopeptydów [1], a ponieważ mają one niezwykle szerokie zastosowanie dla różnych klas związków, w tym polarnych, przemysł farmaceutyczny szeroko zaakceptował je w swoich schematach rozwoju metod chiralnych. Zastosowania obejmują szeroki zakres od alifatycznych do aromatycznych cząsteczek, małych heterocykli do dużych aromatycznych pierścieni połączonych, kwasów, neutralnych i zasad, a także aminokwasów i peptydów.
Kolumny CHIROBIOTIC są wytwarzane przez kowalencyjne wiązanie wysoce selektywnego glikopeptydu z krzemionką o wysokiej czystości w kilku pozycjach, dzięki czemu kolumny są niezwykle wytrzymałe i mogą być stosowane w szerokim zakresie natężenia przepływu i różnych warunkach fazy ruchomej. W serii dostępne są cztery CSP oparte na wankomycynie, teikoplaninie, aglikonie teikoplaniny i ristocetynie. Nie ma żadnych ograniczeń w wyborze rozpuszczalnika (można stosować nawet rozpuszczalniki chlorowane), chociaż niektóre z nich dają większą szansę na selektywność chiralną - jedynym ograniczeniem jest faza odwrócona, gdy stosuje się zakres pH około 3-7 (nieco inny dla każdego CSP).
Dla chiralnych badań przesiewowych istotne jest, aby dostępnych było wiele możliwości faz ruchomych, zarówno w celu zapewnienia różnorodnych enancjoselektywnych oddziaływań między substancją rozpuszczoną a CSP, jak i w celu pokrycia zakresu rozpuszczalności próbki. Siła i dostępność tych enancjoselektywnych mechanizmów będzie się różnić w zależności od fazy ruchomej - na przykład interakcje π-π są silne tylko w rozpuszczalnikach w fazie normalnej, podczas gdy interakcje jonowe są możliwe tylko w fazie odwróconej lub w polarnych (opartych na metanolu) typach faz ruchomych. Skuteczny system przesiewowy będzie obejmował wszystkie z nich.
CHIROBIOTIC CSP są rutynowo stosowane w czterech różnych typach faz ruchomych - polarnym trybie jonowym, polarnym trybie organicznym, fazie odwróconej i fazie normalnej. Polarny tryb jonowy ("PIM") jest unikalny dla faz CHIROBIOTIC dla jonizowalnych cząsteczek. Wykorzystuje on metanol z niewielkimi ilościami kwasu i zasady dodanymi do niego lub metanol z niewielką ilością (zazwyczaj 0,1 g na 100 ml MeOH) stałej lotnej soli amonowej dodanej bezpośrednio do MeOH (może to być octan, trifl uorooctan lub mrówczan).Rysunek 1 przedstawia typowy przykład w tym trybie, popularny ze względu na szybkość i ulepszoną detekcję MS. Polarny tryb organiczny jest kolejnym niewodnym systemem fazy ruchomej, który wykorzystuje pojedyncze lub kombinacje rozpuszczalników i jest skuteczny w tych CSP dla neutralnych cząsteczek. Odwrócona faza jest bardzo podobna do zastosowań RP typu niechiralnego, gdzie zwiększenie zawartości wody zwiększa retencję (z wyjątkiem niektórych zastosowań aminokwasów, gdy jest odwrotnie). Jest to również idealne rozwiązanie dla metod LC/MS. Wreszcie, faza normalna, stanowiąca około 15% wszystkich separacji, wykorzystuje typowe mieszaniny heksanu lub heptanu z alkoholem i zapewnia pewne unikalne separacje. Podręcznik CHIROBIOTIC [2] zawiera przykłady zastosowań wszystkich typów faz ruchomych.
Rysunek 1.Rozdzielanie kwasu 2-bromo-3-metylomasłowego na CHIROBIOTIC R
Przechodząc z jednego typu fazy ruchomej na inny - na tej samej kolumnie - zmienia się mechanizm separacji, dając kolejną możliwość separacji; nie ma efektów pamięci z poprzedniej fazy ruchomej, które mogą wpływać na wyniki. Nasze laboratorium opracowywania metod przez lata opracowywało i zmieniało skład przesiewowy dla każdego typu fazy ruchomej, dzięki czemu są one dostępne, aby bardzo szybko określić, czy dany typ kolumny i typ fazy ruchomej zapewnią pożądaną selektywność. Następnie dostępne są proste techniki optymalizacji w celu opracowania metody w sposób, w jaki jest ona potrzebna (na przykład do wykrywania MS, biokatalizy, analizy rozpuszczania lub zastosowań preparatywnych).
Wyniki
Celem tego systemu przesiewowego jest to, że daje on szybką pozytywną lub negatywną odpowiedź; jeśli pojedynczy, symetryczny pik jest widoczny w czasie pracy - pod warunkiem, że czas retencji wynosi powyżej 10 minut - to ta kolumna lub ta faza ruchoma nie ma prawidłowej selektywności. Jeśli czas retencji jest krótszy niż 10 minut, ważne jest, aby powtórzyć pomiar, rozcieńczając nieco fazę ruchomą; metodę można zawsze przyspieszyć później w ramach procesu optymalizacji. Jeśli występuje rozszczepienie piku lub nawet niewielkie ramię, można przejść do etapów optymalizacji. Aby uzyskać pełny ekran, należy przejść przez cztery przesiewowe fazy ruchome dla każdej kolumny, aby określić najlepszą selektywność. Należy pamiętać, że w przypadku serii CHIROBIOTIC nie występują efekty pamięci, więc każda kolumna może być używana kolejno dla każdego typu fazy ruchomej.
Optimization
Dostępne są proste protokoły optymalizacji dla tych kolumn. Polarny tryb jonowy jest szczególnie łatwy do manipulowania, wykorzystując zmiany stężenia kwasu/zasady lub lotnej soli w celu zwiększenia selektywności i/lub zmiany retencji. Faza normalna i polarny tryb organiczny wykorzystują standardowy wybór modyfikatorów - na przykład różne alkohole - w celu optymalizacji metody; retencja jest po prostu kontrolowana przez polarność rozpuszczalnika. Faza odwrócona wykorzystuje te same zmienne, co w większości metod RP - typ i stężenie buforu, wybór rozpuszczalnika organicznego - w celu zapewnienia najlepszej separacji (Rysunek 2). Ponadto można stosować temperaturę; niższe niż temperatura otoczenia zawsze były stosowane w chiralnych LC w celu znacznego zwiększenia selektywności, ale w przypadku CHIROBIOTYCZNYCH CSP wyższe temperatury są również często stosowane w celu zwiększenia wydajności piku, skrócenia czasu retencji lub odwrócenia kolejności elucji [3]. Kolumny te mogą być używane do 50 oC bez utraty wydajności.
Rysunek 2. Oddzielanie bupiwakainy
Referencje
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?