Kompletny przepływ pracy dla kompleksowej analizy terpenów z konopi indyjskich

Przebieg analizy terpenów w konopiach i marihuanie

Wprowadzenie: Analiza terpenów w marihuanie i konopiach

Terpeny to klasa związków odpowiedzialnych za aromat lub zapach kwiatów konopi. Poszukiwanie przez klientów konopi pożądanego aromatu lub efektu sprawia, że ważne jest określenie profilu terpenowego danej odmiany konopi. Zaproponowano, że terpeny wzmacniają właściwości terapeutyczne kannabinoidów poprzez tak zwany efekt otoczenia. Najbardziej rozpowszechnionym terpenem w konopiach indyjskich jest mircen. Mircen znany jest ze swojego ziemistego, piżmowego zapachu i występuje w wielu odmianach konopi. Oznaczanie ilościowe terpenów można przeprowadzić za pomocą technik takich jak chromatografia gazowa (GC) lub spektrometria mas.

Wobec braku aktualnych uniwersalnych wymogów regulacyjnych dotyczących testowania terpenów, niniejsza nota aplikacyjna ma służyć jako przewodnik dla klientów opracowujących własną analizę pożądanego terpenu. W niniejszym dokumencie proponujemy szybki i skuteczny sposób określenia profilu terpenowego kwiatów konopi lub konopi indyjskich przy użyciu prostej techniki przygotowania próbki opartej na ekstrakcji cieczą. Podejście to skraca czas przygotowania próbki, zużycie rozpuszczalnika i czas uzyskania wyników analitycznych. Ten schemat pracy analizuje 31 terpenów związanych z konopiami indyjskimi za pomocą GC/MS w trybie pełnego skanowania i wykorzystuje certyfikowane wzorce odniesienia. Tridekan jest używany jako wzorzec wewnętrzny, ponieważ nie występuje w próbkach i eluuje w środku chromatogramu. Widma pełnego skanowania mieszaniny wzorców referencyjnych, wzorców kalibracyjnych i próbek zostały przeszukane i dopasowane do biblioteki widm NIST GC/MS. Metodę można łatwo zmodyfikować i dostosować w celu uwzględnienia dodatkowych terpenów będących przedmiotem zainteresowania w celu ich identyfikacji i oznaczenia ilościowego przy użyciu tego samego podejścia.

Struktury chemiczne analitów terpenowych

Przygotowanie próbki i roztworu wzorca wewnętrznego

Instrukcje przygotowania ekstraktu z kwiatów konopi

Krok	Instrukcje
1	Zważ 1.0 g ± 0.001 g próbki zmielonego kwiatu konopi do 50 ml polipropylenowej probówki wirówkowej
2	.Dodaj 10 mL octanu etylu klasy GC do każdej probówki i zakryj
3	Sonicate for 15 minutes<
4	Wiruj próbówkę z prędkością 1252 x g przez 5 minut
5	Przenieść 1 ml supernatantu do fiolki autosamplera o pojemności 2 ml i zakorkować

Instrukcje przygotowania roztworów wzorców wewnętrznych

Krok	Instrukcje
1	Dodaj 3.31 µL tridekanu do kolby pomiarowej o pojemności 25 mL
2	Dopełnij do pełnej objętości kolby octanem etylu o czystości GC
3	Przenieść 1 mL roztworu wzorca wewnętrznego (ISTD) do fiolki autosamplera GC o pojemności 2 mL
4	Umieść w odpowiednim miejscu autosamplera, aby wykonać wstrzyknięcie kanapkowe wzorca wewnętrznego
	Daje to 100 ppm [µg/mL] roztwór ISTD

Instrukcje przygotowania roboczych roztworów wzorcowych

Krok	Instrukcje
1	Przenieś 500 µL Cannabis Terpenes Standard Mix A CRM [2000 µg/mL] do bursztynowej fiolki o pojemności 10 ml
2	Transfer 500 µL mieszaniny standardowej A CRM [2000 µL Cannabis Terpenes Standard Mix B CRM [2000 µg/mL] do tej samej 10 mL bursztynowej fiolki powyżej
3	Dodaj 1.00 mL octanu etylu klasy GC do tej samej bursztynowej fiolki o pojemności 10 mL i zakorkować
	W ten sposób uzyskuje się roboczy roztwór wzorcowy o stężeniu 500 ppm [µg/mL] do przygotowania rozcieńczeń dla krzywej kalibracyjnej przyrządu przy użyciu schematu rozcieńczania wzorca krzywej kalibracyjnej. Przechowuj robocze roztwory wzorcowe i wszelkie pozostałe mieszaniny CRM zgodnie z wytycznymi dotyczącymi etykietowania.

Schemat rozcieńczania standardowej krzywej kalibracyjnej

Schemat rozcieńczania wzorca krzywej kalibracyjnej. Roboczy roztwór wzorcowy (WS): 500 µg/ml w octanie etylu o czystości GC Cal 1: Aby przygotować, dodać 15 µL Cal 7 (50 ppm) do 985 µL octanu etylu o czystości GC.

Poziom	Konc. [µg/ml, ppm]	µL roztworu	Roztwór	µL octanu etylu do dodania
Cal 1	0.75	15	Cal 7	985
Cal 2	1	2	WS	998
Cal 3	2	4	WS	996
Cal 4	5	10	WS	990
Cal 5	10	20	WS	980
Cal 6	25	50	WS	950
Cal 7	50	100	WS	900
Cal 8	70	140	WS	860
Cal 9	100	200	WS	800

Warunki pracy urządzenia GC-MS

Warunki GC
Kolumna	SLB®-5ms 20 m x 0.180 mm ID; 0.18 µM grubości warstwy
Detektor	GC-MS z soczewką o średnicy 9 mm
.Wlot	300 °C
Temperatura kolumny	45 °C przez 2 minuty, następnie 10 °C/min do 140 °C, utrzymywanie 140 °C przez 0.5 minut, następnie 30°C/min do 300°C, utrzymywanie 300°C przez 2 minuty
Przepływ	0.Stały przepływ 75 ml/min
Gaz nośny	Hel
Liner	Single Taper FocusLiner™ z watą szklaną
Injection	2.0 µL - Pulsed Split 50:1
Rozcieńczalnik do próbek	Octan etylu
Przygotowanie próbki	Ekstrakcja ciało stałe-ciecz z octanem etylu (1 g konopi + 10 ml octanu etylu
Roztwór standardowy	Rozcieńczenia mieszaniny A i mieszaniny B terpenów z konopi indyjskich w octanie etylu (0. 75- 100 ppm z 100 ppm).75-100 ppm) z 100 ppm Tridekanu jako ISTD Sandwich Injection
Próbka	1-gramowy kwiat konopi zawierający mniej niż 0,3% THC

Warunki pracy spektrometru masowego

.Warunki MS
Strojenie	Autostrojenie
Akwizycja	Tryb pełnego skanowania (EI); 40-400 amu
Opóźnienie rozpuszczalnika	4 min
Temperatura źródła MS	300 °C
Temperatura kwadrupolu	150 °C
Energia elektronów	70 eV
Czas oczekiwania	50 ms

Chromatogram TIC mieszaniny wzorców terpenów

Wykrywanie i kalibracja

Wykrywanie i kalibracja α-pinenu metodą GC-MS

Nałożone EIC dziewięciu wzorców α-Pinenu

Trzy wstrzyknięcia 50 mg/ml wzorca α-pinenu

Szczyt	Związek	Czas retencji (min)	KwantQuant (m/z)	Qual 1 (m/z)	Qual 2 (m/z)	Gain
1	α-Pinene	5.260	93	105	121	10

.Poziom	α-Pinene (μg/mL)
1	0.75ppm
2	1ppm
3	2ppm
4	5ppm
5	10ppm
6	25ppm
7	50ppm
8	70ppm
9	100ppm

Standardowa powtarzalność (0.75 μg/mL/)	Peak Area
STD1 Injection 1	3052
STD1 Injection 2	3262
STD1 Injection 3	3098
Mean	3137.60
Odchylenie standardowe	110.37
RSD (%)	3.52

Krzywa kalibracji dla wzorców α-Pinenu od 0,75 µg/ml do 100 µg/ml

Liniowość, LOD i LOQ
Stężenie (μg/mL)	ISTD Resp. Ratio
0,75	0.016
1	0.032
2	0.079
5	0.183
10	0.374
25	0.916
50	1.814
70	2.499
100	3.589
LOD	0.25 μg/mL
LOQ	0.75 μg/mL

Wykrywanie i kalibracja kamfenu metodą GC-MS

Nałożone EIC dziewięciu standardów Camphene

Trzy wstrzyknięcia 50 mg/ml wzorca kamfenu

Szczyt	Związek	Czas retencji (min)	KwantQuant (m/z)	Qual 1 (m/z)	Qual 2 (m/z)	Zdobycie
2	Kamfen	5.551	93	121	79	10

.Poziom	α-Pinene (g/mL)
1	0.75ppm
2	1ppm
3	2ppm
4	5ppm
5	10ppm
6	25ppm
7	50ppm
8	70ppm
9	100ppm

Standardowa powtarzalność (0.75 μg/ml/)	Peak Area
STD1 Injection 1	1702
STD1 Injection 2	1660
STD1 Zastrzyk 3	1632
Średnia	1665
Odchylenie standardowe	35.41
RSD (%)	2.13

Krzywa kalibracji dla wzorców α-Terpinenu od 0,75 µg/ml do 100 µg/ml

Liniowość, LOD i LOQ
Stężenie (μg/mL)	ISTD Resp. Ratio
0,75	0.007
1	0.017
2	0.043
5	0.107
10	0.234
25	0.616
50	1.256
70	1.7726
100	2.5716
LOD	0.25 μg/mL
LOQ	0.75 μg/mL

Wykrywanie i kalibracja α-terpinenu metodą GC-MS

Nałożone EIC dziewięciu wzorców α-Terpinenu

Trzy wstrzyknięcia 50 mg/ml wzorca α-Terpinenu

Szczyt	Związek	Czas retencji (min)	KwantQuant (m/z)	Qual 1 (m/z)	Qual 2 (m/z)	Gain
5	α-Terpinene	6.726	121	136	105	10

.Poziom	α-Pinene (g/mL)
1	0.75ppm
2	1ppm
3	2ppm
4	5ppm
5	10ppm
6	25ppm
7	50ppm
8	70ppm
9	100ppm

Standardowa powtarzalność (0.75 μg/ml/)	Peak Area
STD1 Injection 1	1702
STD1 Injection 2	1660
STD1 Zastrzyk 3	1632
Średnia	1665
Odchylenie standardowe	35.41
RSD (%)	2.13

Krzywa kalibracji dla wzorców α-Terpinenu od 0,75 µg/ml do 100 µg/ml

Liniowość, LOD i LOQ
Stężenie (μg/mL)	ISTD Resp. Ratio
0,75	0.007
1	0.017
2	0.043
5	0.107
10	0.234
25	0.616
50	1.256
70	1.7726
100	2.5716
LOD	0.25 μg/mL
LOQ	0.75 μg/mL

Powtarzalność odpowiedzi ISTD tridekanu

Poziom	Ret. Czas [min]	Tridecane ISTD Response
1	11.050	196767
2	11.050	197806
3	11.051	197399
4	11.051	202600
5	11.051	207489
6	11.049	212668
7	11.049	217217
8	11.050	220822
9	11.050	220802
% RSD	0.006 %	4.82 %

Nałożone chromatogramy EIC 9 wstrzyknięć tridekanu ISTD z krzywej kalibracyjnej

TIC wyekstrahowanej próbki konopi

Chromatogram wyekstrahowanego związku z próbki konopi

Ukierunkowana biblioteka MS utworzona z Cannabis Terpene CRM Mix A & B

Widmo MS piku przy 13,082 min α-humulenu

Tabelaryczne wyniki dla 31 terpenów z konopi indyjskich i IS

Peaks	Compound	CAS No.	Ret. Czas [min]	Współczynnik dopasowania lib	r2	Zakres [μg/mL]	Wykryto w próbce konopi?
1	α-Pinene	80-56-8	5.257	98.99	0.99991	0.75-100	Y
2	Camphene	79-92-5	5.553	99.00	0.99990	0.75-100	Y
3	β-Pinene	127-91-3	6.049	99.17	0.99995	1.50-200	Y
4	3-Carene	13466-78-9	6.589	99.15	0.99992	1.50-200	Y
5	α-Terpinene	99-86-5	6.726	99.62	0.99987	0.75-100	Y
6	p-Cymene	99-87-6	6.856	99.58	0.99987	0.75-100	Y
7	Limonen	138-86-3	6.938	99.21	0.99997	1.50-200	Y
8	γ-Terpinene	99-85-4	7.422	99.35	0.99994	0.75-100	Y
9	.Terpinolene	586-62-9	7.872	99.21	0.99990	0.75-100	N
10	.L-Fenchone	7787-20-4	7.930	99.47	0.99989	0.75-100	Y
11	Linalool	78-70-6	8.101	99.37	0.99915	0.75-100	Y
12	Fenchol	2217-02-9	8.426	99.43	0.99996	0.75-100	Y
13	Kamfora	76-22-2	8.866	99.57	0.99997	1.50-200	Y
14	.Izoborneol	124-76-5	9.126	99.45	0.99983	0.75-100	Y
15	.(+)-Borneol	464-43-7	9.259	99.36	0.99968	0.75-100	Y
16	.DL-Menthol	89-78-1	9.331	99.52	0.99988	0.75-100	Y
17	α-Terpineol	10482-56-1	9.596	99.34	0.99942	0.75-100	Y
18	.Citronellol	106-22-9	10.036	99.05	0.99961	0.75-100	Y
19	Pulegone	89-82-7	10.234	99.55	0.99956	0.75-100	Y
20	Geraniol	106-24-1	10.386	98.21	0.99946	0.75-100	Y
21	Octan geranylu	105-87-3	12.145	98.64	0.99980	0.75-100	Y
22	α-Cedren	469-61-4	12.699	99.62	0.99997	0.75-100	N
23	β-Caryophellene	87-44-5	12.728	99.68	0.99953	0.75-100	Y
24	α-Humulen	6753-98-6	13.082	98.90	0.99975	0.75-100	Y
25	.Nerolidol I	7212-44-4	13.636	98.73	0.99913	1.50-200	Y
26	.Nerolidol II	7212-44-4	13.845	99.19	0.99905		Y
27	Cedrol	77-53-2	14.226	99.46	0.99978	0.75-100	Y
28	β-Eudesmol	473-15-4	14.471	99.60	0.99945	0.75-100	Y
29	α-bisabolol	23089-26-1	14.594	99.62	0.99965	0.75-100	Y
30	Phytol I	7541-49-3	16.145	92.91	0.99975	0.75-100	Y
31	.Phytol II	7541-49-3	16.225	92.91	0.99950		Y
ISTD	.Tridecane	629-50-5	11.050	96.17	******	100 ppm

Wnioski

Opracowano szybką, wydajną i wysoce powtarzalną metodę analityczną do analizy ilościowej 31 terpenów związanych z konopiami indyjskimi przy użyciu GC-MS. Supelco^® materiały eksploatacyjne do chromatografii, rozpuszczalniki, materiały eksploatacyjne, odczynniki analityczne i certyfikowane wzorce odniesienia w połączeniu z GC-MS zapewniają skuteczny sposób analizy produktów z konopi indyjskich pod kątem terpenów w celu spełnienia obecnych wymagań dotyczących etykietowania produktów z konopi indyjskich. Niskie poziomy kwantyfikacji wynoszące 0,75 µg/g (750ppb) są łatwe do osiągnięcia. Uzyskanie wszystkich materiałów eksploatacyjnych i odczynników od jednego dostawcy zapewnia również, że czas poświęcony na analizę i prowadzenie próbek jest dobrze wykorzystany, zamiast szukania wielu źródeł wymaganych materiałów analitycznych. Zastosowanie kolumny GC o wymiarach 20 m x 0,18 mm x 0,18 μM zapewnia najwyższą rozdzielczość chromatograficzną analitów terpenowych i ułatwia analizę dodatkowych analitów w przyszłości, jeśli zajdzie taka potrzeba.