Testy multipleksowe sygnalizacji komórkowej
- Korzyści z multipleksowania szlaków sygnalizacji komórkowej
- Jak multipleksowe testy sygnalizacji komórkowej są wykorzystywane w badaniach
o Analiza członków rodziny Bcl-2 i interakcji białko-białko
o Specific Detection of Mutant Ras Oncoproteins in Cell and Tissue Lysates - Tips on Using MILLIPLEX® Cell Signaling Assays
- Powiązane produkty
- Powiązane seminaria internetowe
Pomiar aktywacji szlaków sygnalizacji komórkowej za pomocą multipleksowych testów opartych na kulkach MILLIPLEX®. Multipleksowanie za pomocą testów fosfoprotein sygnalizacji komórkowej opartych na technologii Luminex® xMAP® pomaga badaczom mierzyć wiele fosfoprotein lub całkowitych białek w ramach tego samego szlaku lub różnych szlaków z jednej próbki. Czytaj dalej, aby zobaczyć, w jaki sposób może to przyspieszyć badania nad rakiem, immunologią/zapaleniem, toksycznością i nie tylko.
Korzyści z multipleksowania szlaków sygnalizacji komórkowej
Multipleksowanie zapewnia szybsze odpowiedzi na pytania dotyczące szlaków wewnątrzkomórkowych w porównaniu z tradycyjnymi testami Western blot, spektrometrii masowej i fosforylacji radioaktywnej, które wymagają dużych ilości próbek. Na przykład, dzięki testom multipleksowym MILLIPLEX®, opartym na technologii Luminex® xMAP®, naukowcy otrzymują dar w postaci czasu i próbki. Tabela 1 przedstawia porównanie testów MILLIPLEX® z testami Western blot.
Zestawy i panele multipleksowe szlaków wewnątrzkomórkowych MILLIPLEX® są weryfikowane analitycznie przy użyciu tych samych rygorystycznych kryteriów wydajności stosowanych do produkcji naszych zestawów biomarkerów krążących i są zoptymalizowane w celu uzyskania maksymalnej ilości danych z cennych próbek. Nasze testy sygnalizacji komórkowej umożliwiają dokładną względną kwantyfikację zarówno całkowitych, jak i fosforylowanych form białek sygnalizacyjnych, ujawniając połączenia i przesłuch w ramach interesujących Cię ścieżek.
Te zweryfikowane analitycznie zestawy do oznaczania szlaków wewnątrzkomórkowych oferują:
- Stymulowane i niestymulowane lizaty komórkowe w celu zakwalifikowania wydajności testu
- Premixowane kulki magnetyczne do wychwytywania interesujących analitów
- Koktajle przeciwciał detekcyjnych zaprojektowane w celu uzyskania spójnych profili analitów w panelu<
- Względne dane ilościowe dotyczące krotnego wzrostu (mediana intensywności fluorescencji, MFI)
Jak multipleksowe testy sygnalizacji komórkowej są wykorzystywane w badaniach
Testy multipleksowe sygnalizacji komórkowej pomagają porównać poziomy fosfoprotein i białek całkowitych z próbki, co daje wgląd w różne szlaki sygnałowe, w tym rak, zapalenie, a nawet układ endokannabinoidowy. Przykłady szlaków wewnątrzkomórkowych, które są analizowane za pomocą zestawów multipleksowych obejmują:
- Akt/mTOR
- Apoptoza
- Rodzina Bcl-2
- Uszkodzenia DNA/Genotoksyczność
- MAPK/SAPK
- NFκB
W szczególności, testy sygnalizacji komórkowej mają kluczowe znaczenie w badaniach nad rakiem ze względu na złożone szlaki sygnałowe zaangażowane w raka i przerzuty. Poniżej opisano przykłady wykorzystania przez naukowców multipleksowych testów sygnalizacji komórkowej MILLIPLEX® w badaniach nad rakiem.
Analiza członków rodziny Bcl-2 i interakcji białko-białko
Członkowie rodziny Bcl-2 odgrywają bardzo ważną rolę w wewnętrznych szlakach apoptotycznych. Rodzina ta składa się z ponad 17 członków, których można funkcjonalnie podzielić na podrodziny proapoptotyczne i antyapoptotyczne. Interakcje między tymi członkami rodziny determinują los komórek, a rozregulowanie może prowadzić do wzrostu guza i przeżycia komórek nowotworowych.
W badaniach klinicznych znajduje się kilka badanych leków stosowanych w leczeniu raka, których celem są członkowie rodziny Bcl-2, co zwiększa zapotrzebowanie na solidne testy do pomiaru członków rodziny Bcl-2 i ich interakcji. Chociaż istniejące testy mierzą członków rodziny Bcl-2, brakuje wiarygodnych testów do jednoczesnej oceny całkowitych białek i interakcji białko-białko. Aby rozwiązać ten problem, opracowano dwa panele multipleksowych testów immunologicznych opartych na technologii Luminex®, które pozwalają na jednoczesne wykrywanie wielu składników rodziny Bcl-2 w jednym dołku, w tym całkowitego Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1, BAD, BIM i BAX, a także interakcji białkowych, takich jak Mcl-1/BIM, Bcl-xL/BAD i NOXA/Mcl-1* (*dane nie pokazane).
Używając MILLIPLEX® Bcl-2 Family Apoptosis Panel 1 i Panel 2, zmiany w ekspresji i interakcjach białek takich jak Mcl-1/BIML, Bcl-xL/BAD i NOXA/Mcl-1* (*danych nie przedstawiono).Zmiany w ekspresji i interakcjach członków rodziny Bcl-2 analizowano w odpowiedzi na znane leki apoptotyczne, w tym kamptotecynę (inhibitor topoizomerazy), anizomycynę (inhibitor translacji białek) i AT101 (lek naśladujący BH3). Kamptotecyna i anizomycyna wywołały znaczny spadek poziomu Mcl-1, a także niewielki spadek poziomu BIM. Dodatkowo, interakcja Mcl-1/BIM została zakłócona zarówno przez kamptotecynę, jak i anizomycynę, prawdopodobnie z powodu obniżonego poziomu obu białek.
AT101, z drugiej strony, nie miał znaczącego wpływu ani na poziom Mcl-1, ani na interakcję Mcl-1/BIM. W przeciwieństwie do ich odmiennego wpływu na interakcję Mcl-1/BIM, wszystkie trzy leki działały podobnie w blokowaniu interakcji Bcl-xL/BAD bez wpływu na całkowity poziom któregokolwiek z białek. Rysunki 1 i 2 przedstawiają dane z badania zależnego od dawki leku w linii komórkowej MCF7 przy użyciu MILLIPLEX® Bcl-2 Family Apoptosis Panel 1 i Panel 2 odpowiednio.
Rysunek 1.Analiza zależności dawki leku została zakończona przy użyciu MILLIPLEX® Bcl-2 Family Apoptosis Panel 1. Komórki MCF7 traktowano stężeniami 0, 1, 2, 5, 10 i 20 μM kamptotecyny, anizomycyny i AT101 przez 16 godzin. 20 μg białka całkowitego każdego lizatu rozcieńczonego w buforze testowym MILLIPLEX® Assay Buffer 1 analizowano zgodnie z protokołem testu (inkubacja lizatu w temperaturze 4°C przez noc).
Rysunek 2. Analiza zależności dawki leku została zakończona przy użyciu MILLIPLEX® Bcl-2 Family Apoptosis Panel 2. Komórki MCF7 traktowano stężeniami 0, 1, 2, 5, 10 i 20 μM kamptotecyny, anizomycyny i AT101 przez 16 godzin. 20 μg białka całkowitego każdego lizatu rozcieńczonego w buforze MILLIPLEX® Assay Buffer 1 analizowano zgodnie z protokołem testu (inkubacja lizatu w temperaturze 4°C przez noc). Uwaga, dane nie zostały przedstawione dla interakcji białka NOXA/Mcl-1.
Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te ilustrują dynamiczne reakcje rodziny Bcl-2 na leki indukujące apoptozę. Opisane tu nowe multipleksowe testy immunologiczne MILLIPLEX® stanowią potężne narzędzie do badania podstawowych mechanizmów regulujących rodzinę białek Bcl-2.
Specific Detection of Mutant Ras Oncoproteins in Cell and Tissue Lysates
Białka Ras (HRAS, KRAS i NRAS) są małymi GTPazami, które funkcjonują jako przełączniki molekularne, zmieniając się między nieaktywnymi stanami związanymi z GDP i aktywnymi stanami związanymi z GTP. Ras-GTP aktywuje dalsze szlaki, w tym szlak MAPK, wiążąc się z kinazą Raf i 3-kinazą fosfatydyloinozytolu (PI3K) w celu promowania proliferacji komórkowej, przeżycia, wzrostu i różnicowania. Onkogenne mutacje Ras występują w około 25% nowotworów u ludzi. Ponadto 90% nowotworów trzustki zawiera mutacje KRAS, przy czym 80% mutacji KRAS występuje w kodonie 12, przy czym Ras G12V i G12D są najbardziej rozpowszechnione.
Ścieżka Ras-Raf-MEK może być również aktywowana za Ras. BRAF jest dobrze znanym onkogenem, a mutacja BRAF V600E jest powszechna w czerniaku. Podczas gdy celowanie w tę onkoproteinę BRAF ma skuteczność terapeutyczną, leczenie nowotworów napędzanych przez onkoproteiny Ras pozostaje pilną niezaspokojoną potrzebą kliniczną.
Panel koralików magnetycznych MILLIPLEX® Ras-Raf Oncoprotein Magnetic Bead Panel został opracowany w celu jednoczesnego wykrywania całkowitego Ras, Ras G12V, Ras G12D, fosfo-MEK1 (S217/S221), fosfo-BRAF (S446) i fosfo-CRAF (S338) w jednym dołku. Ten multipleksowy test wykrywa izoformy H-Ras, N-Ras i K-Ras dla całkowitego Ras, RasG12D i RasG12V. Aby potwierdzić specyficzne rozpoznawanie zmutowanych onkoprotein Ras, zestaw ten może wykrywać znaną mutację KRAS G12V znalezioną odpowiednio w linii komórkowej COR-L23 i mutację NRAS G12D znalezioną w linii komórkowej THP-1 (Rysunek 3).
Rysunek 3. Komórki THP-1 i COR-L23 poddano działaniu 2 μM wemurafenibu lub 125 nM dabrafenibu przez 72 godziny, po czym komórki zebrano, a lizaty komórkowe przeanalizowano przy użyciu MILLIPLEX® Ras-Raf Oncoprotein Panel. Nie zaobserwowano żadnego wpływu wemurafenibu lub dabrafenibu na te linie komórkowe pozbawione mutacji BRAF.
Ponadto, odpowiedź na inhibitory BRAF, wemurafenib i dabrafenib, została porównana pomiędzy komórkami MDA-MB-435S, które zawierają mutację BRAF V600E, a niewrażliwymi liniami komórkowymi, przy użyciu multipleksowych testów immunologicznych (Ryc. 4).
Rysunek 4. Komórki MDA-MB-435S z mutacją BRAF V600E poddano działaniu 2 μM wemurafenibu lub 125 nM dabrafenibu przez 72 godziny. Komórki zbierano, a lizaty analizowano przy użyciu MILLIPLEX® Multi-Pathway, Akt/mTOR (Phosphoprotein) i Ras-Raf Oncoprotein Paneli.
Dalsze, komercyjnie pozyskiwane lizaty tkankowe analizowano przy użyciu guza i sąsiedniej tkanki od pacjenta z rakiem okrężnicy z mutacją KRAS G12D. Wreszcie, egzosomy zostały wzbogacone z surowicy raka trzustki i przetestowane przy użyciu Panelu Onkoprotein Ras-Raf (dane nie pokazane). Dane te pokazują użyteczność badania wpływu onkoprotein Ras za pomocą multipleksowych testów immunologicznych MILLIPLEX® w wielu typach próbek, w tym lizatach komórkowych, tkankowych i egzosomalnych.
Wskazówki dotyczące korzystania z testów sygnalizacji komórkowej MILLIPLEX®
Niżej opisano kilka porad i wskazówek dotyczących korzystania z naszych testów sygnalizacji komórkowej MILLIPLEX® singleplex i multiplex.
Używanie testów sygnalizacji komórkowej MAPmate™ (Singleplex)
- Pleksowe testy kontroli ładowania MAPmate™ do istniejących paneli sygnalizacji komórkowej MILLIPLEX® w celu ulepszenia panelu zgodnie z wytycznymi zawartymi w protokołach.
- Nasz Cell Signaling Buffer & Detection Kit można zakupić, jeśli wymagane są dodatkowe bufory.
- Płytka z płaskim dnem jest dołączona dla wygody.
"Plexing" Cell Signaling MAPmate™ Assays
- Testy MAPmate™ można dodać do istniejących zestawów sygnalizacji komórkowej, aby służyły jako kontrole.
- Odnieś się do wytycznych zawartych w protokole zestawu.
- GAPDH i β-Tubulina MAPmate™ mogą być używane do normalizacji z dowolnym testem MAPmate™.
Przygotowanie lizatów komórkowych do testów sygnalizacji komórkowej w 96-dołkowych płytkach
- Dla adherentnych linii komórkowych: wysiej ~40 000 komórek/dołek i pozwól na wzrost przez 48 godzin.
- Dla zawiesinowych linii komórkowych: wysiej ~250 000 komórek na studzienkę i zbierz je w żądanym czasie.
- Dla lizy komórek: dodaj 30 µL buforu do lizy na studzienkę i dokładnie pipetuj w górę i w dół, nie tworząc zbyt wielu pęcherzyków. Poproś o bardziej szczegółowy protokół od pomocy technicznej.
- Nieuszkodzone komórki/części można usunąć przez filtrację lub odwirowanie.
- Bufor lizujący można znaleźć w Cell Signaling Buffer & Detection Kit lub jest sprzedawany oddzielnie.
- Dodaj inhibitory proteazy (takie jak Protease Inhibitor Cocktail I<; AEBSF) i/lub inhibitory fosfatazy do "domowych" buforów lizujących.
- Wykonaj wszystkie rozcieńczenia buforem do lizy (nie buforem testowym lub solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS)).
Powiązane produkty
Oferujemy trzy formaty zestawów testów sygnalizacji komórkowej MILLIPLEX®, aby spełnić różnorodne potrzeby badawcze.
Premieksowe testy fosfoprotein i całkowitych białek sygnalizacji komórkowej
- Pomiar wielu fosfoprotein lub całkowitych białek w obrębie lub w obrębie różnych ścieżek w jednej próbce
- Uzyskanie względnie ilościowych danych dotyczących wzrostu krotności z multipleksowych zestawów testów sygnalizacji
Cell Signaling Phosphoprotein + Total 2-Plex Assays
- Bezpośrednie porównanie poziomów fosfoprotein i białek całkowitych w próbce poprzez odczyt w tej samej studzience
- Połącz z innymi testami fosforylacji/całkowitej ekspresji 2-Plex, aby badać fosforylację wielu białek jednocześnie. całkowity poziom białka w próbce poprzez odczyt w tej samej studzience
- Połącz z innymi testami fosforo/całkowitymi 2-Plex, aby badać fosforylację i całkowitą ekspresję wielu białek jednocześnie
- Uzyskaj względnie ilościowe dane dotyczące krotnego wzrostu z multipleksowanych zestawów testów sygnałowych
Zestawy kontroli ładowania i odczynników Singleplex MAPmate™
- Anality MAPmate™ są białkami utrzymującymi, które można stosować z istniejącymi panelami MILLIPLEX® Cell Signaling Panels jako kontrole ładowania
- Wyjątek: zestawy zawierające detekcję panTyr (takie jak MILLIPLEX® RTK Phosphoprotein Magnetic Bead Panel i MILLIPLEX® T-Cell Receptor Signaling Magnetic Bead 7-Plex Kit) nie mogą być plexowane z tymi kontrolami ładowania - Zestawy MAPmate™ są testami typu singleplex<
- Każdy test kontroli ładowania MAPmate™ zawiera przeciwciało wychwytujące (sprzężone z kulkami) i przeciwciało wykrywające (sprzężone z biotyną)
- Jeśli wymagane są dodatkowe bufory, można zakupić zestaw buforów do wykrywania i sygnalizacji komórkowej
- zawiera on bufor do lizy MILLIPLEX® , bufor do testów, streptawidyna-fikoerytryna, bufor do amplifikacji, niestymulowany lizat komórek HeLa oraz 96-dołkowa płytka z 2 uszczelniaczami
.
Uwaga: Aby wyświetlić anality, miejsca fosforylacji i reaktywność gatunków dla każdego panelu, pobierz naszą broszurę Analyte Quarterly. Wszystkie zestawy są prefiksowane, z wyjątkiem MILLIPLEX® RTK Phosphoprotein Magnetic Bead Panel, który można dostosować.
Tylko do użytku badawczego. Nie do użytku w procedurach diagnostycznych.
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?