この手順はコラゲナーゼ製品に使用できます。
連続分光光度法による速度測定（A345、光路=1 cm）は、以下の反応に基づいています。
FALGPA = N-(3-[2-フリル]アクリロイル)-Leu-Gly-Pro-Ala
FAL = N-(3[2-フリル]アクリロイル)-Leu
ユニットの定義–コラゲナーゼ1ユニットは、カルシウムイオン存在下で、25℃、pH 7.5で1分につき1.0 μmolのFALGPAを加水分解します。
必要な試薬・装置
- トリシン（カタログ番号T0377）
- 5.0 M塩化ナトリウム溶液（カタログ番号S6546）
- 1 M水酸化ナトリウム溶液（カタログ番号S2567）
- 1 M塩化カルシウム溶液（カタログ番号21115）
- 1 M塩酸溶液（カタログ番号H3162）
- FALGPA（カタログ番号F5135）
使用上の注意
危険性と安全な取り扱いについては、安全データシートをご覧ください。
調製手順の概要
試薬の調製には超純水（比抵抗18 MΩxcm以上、25℃）を使用します。
バッファー（10 mM塩化カルシウムおよび400 mM塩化ナトリウム含有50 mMトリシン、pH 7.5、25℃）–トリシン約2.24 g（カタログ番号T0377）を適切なビーカーに秤量します。超純水200 mLを添加します。5.0 M塩化ナトリウム溶液（カタログ番号S6546）20 mLを添加します。十分に混和し、1～5 M NaOHまたはHClを用いて溶液をpH 7.5、25℃に調整します。pH調整後、カタログ番号21115を用いて調製した100 mM塩化カルシウム溶液 25 mLを添加します。純水を添加し、最終容量250 mLにします。必要に応じ、1～5 M NaOHまたはHClを用いてpH 7.5、25℃に調整します。
FALGPA溶液（1.0 mM N-(3-[2-フリル]アクリロイル)-Leu-Gly-Pro-Ala）–バッファー中でN-(3-[2-フリル]アクリロイル)-Leu-Gly-Pro-Ala（カタログ番号F5135）を用いて補正済0.48 mg/mL（1.0 mM）溶液を調製します。使用したFALGPAの特定のロットの含水量を基に濃度を補正します。完全に溶解させるため、少なくとも30分攪拌します。必要に応じ、1 M水酸化ナトリウム溶液（カタログ番号S2567）または1 M塩酸溶液（カタログ番号H3162）を用いてpH 7.5、25℃に調整します。
酵素溶液–使用直前に、冷却（2～8℃）した超純水でコラゲナーゼ2 ユニット／mL含有溶液を調製します。
手順
反応ミックス3.00 mLの最終濃度は48.3 mMトリシン、9.67 mM塩化カルシウム、387 mM塩化ナトリウム、0.967 mM FALGPA、および0.20ユニットコラゲナーゼが含まれています。
1.以下を適切な容器にピペットで移します。
2.転倒混和し、適切に温度調節された分光光度計を用いて25℃に平衡化します。
3.次に以下を添加します。
4.速やかに転倒混和し、A345で約5分、低下量を記録します。少なくとも1つの1分間隔データと4つのデータポイントの最低値を使用して、すべての検体とブランクの最大線形速度（ΔA345／分）を求めます。
結果
計算式
1.
| ユニット／mL酵素 = | (ΔA345／分 検体–ΔA345／分 ブランク)(3.00)(df) | |
| (0.53)(0.10) |
ここに、
3.00 = 反応混合液の総容量（mL）
df = 希釈係数
0.53 = 実験で測定された、345 nmでのFALGPAのミリモル吸光係数。これは、345 nmでのFALGPAミリモルあたりの吸光度最大減少量と直接関連します。
0.10 =使用した酵素溶液の容量（mL）
2.
| ユニット／mg solid = | ユニット／mL酵素 | |
| mg solid/mL酵素 |
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