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アルカリホスファターゼ（AP）プロトコル

タンパク質の脱リン酸化

アルカリホスファターゼ（AP、製品番号API-RO）は、幅広い種類の有機一リン酸の加水分解を触媒する非特異的リン酸モノエステル加水分解酵素です。自然界でのAPの広範な発現は、基本的な生化学的プロセスにAPが関与していることを示唆するものですが、その生理学的機能、または天然基質の性質に関する肯定的な証拠はありません。APの考えうる機能としては、ホスホエステルの加水分解、リン酸トランスフェラーゼ活性、プロテインホスファターゼ活性、リン酸輸送、有機カチオン輸送の調節、細胞増殖への関与などが示されています。

仔ウシ腸由来アルカリホスファターゼ（CIAP）を使用したタンパク質の脱リン酸化については、Roche Applied Scienceの次の2つの出版物で説明されています。

Huang K, Huang FL. 1980. Dephosphorylation of rabbit skeletal muscle glycogen synthase by phosphoprotein phosphatase and human placental alkaline phosphatase. Biochemical and Biophysical Research Communications. 92(2):682-687. https://doi.org/10.1016/0006-291x(80)90387-3

Brugg B, Matus A. 1991. Phosphorylation determines the binding of microtubule-associated protein 2 (MAP2) to microtubules in living cells.. 114(4):735-743. https://doi.org/10.1083/jcb.114.4.735

CIAPによる脱リン酸化は以下のプロトコルに従って実施

リファレンス1：50 mM Tris-Clバッファー、pH 7.5を含む反応ミックス中。1 mMジチオスレイトール、5%グリセロール、5 mM MgCl₂、0.1〜0.2 mg/mLのリンタンパク質、および10 Uアルカリホスファターゼ。

リファレンス2：熱安定性の高いMAP（5 mg/mL）を、0.1 M Tris HCI、pH 8.4、1 mM MgCl₂、1 mM EGTA、1 mM EDTA、2 mM PMSF、1 µg/mLペプスタチン、1 U/mLアプロチニン、および0.1 mM ZnCl₂を含むバッファーで仔ウシ腸由来ホスファターゼを使用して37℃の条件下で12時間処理しました。テストされた市販の調製物のうち、Boehringer Mannheim製のもの（Roche Applied Scienceカタログ番号713 023、25 U/mL）だけが、MAPに対する検出可能なタンパク質分解活性の欠如と良好なホスファターゼ活性の組み合わせを示しました。プロテアーゼ阻害剤はすべての実験で使用されました。最大の脱リン酸化を達成するため、新しいホスファターゼを3時間ごとに反応液に加え、最終濃度を100 U/mLにしました。続いて、沸騰した水槽で2分間加熱することにより、ホスファターゼを不活性化しました。

注記：APによる脱リン酸化では、立体障害が原因ですべてのリン酸化部位に接近できるとは限りません。そのような部位には、AP以外のホスファターゼ（特異的リンタンパク質ホスファターゼや酸性ホスファターゼなど）を使用する必要があります。

不活性化

アルカリホスファターゼは、熱によって不活化される可能性があります。反応液を65℃で10分間加熱した後、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（50:48:2）で少なくとも1回抽出します。熱によるAPの不活性化は、タンパク質濃度と二価イオン（Mg²⁺、Zn²⁺）濃度に依存します。脱リン酸化反応後に分子生物学グレードのAPを不活性化するには、50 mM EGTA（EDTAではない。二価カチオンをキレート化するためにEGTAが必要）の存在下で反応液を65℃で30分間加熱した後、フェノールで抽出し、エタノールで核酸を沈殿させます。

必要なEGTAの量は、反応ミックスのMg²⁺濃度によって異なります。反応ミックスにMg²⁺が含まれていない場合は、5 mM EGTA（最終濃度）を使用します。反応ミックスに1 mM Mg²⁺が含まれている場合は、10 mM EGTAを使用します。AP濃度が0.3 U/10 µLを超える場合は、APが以降のステップに干渉しないように、フェノール抽出を不活性化手順に常に含める必要があります。ただし、時間または核酸量がエタノール沈殿を妨げる要因になっている場合は、通常、EGTAの存在下で65℃のインキュベーション時間を長くすれば（最大45分）、APを完全に不活性化するのに十分です。加熱ステップ中、反応ミックスを10分ごとに短時間（数秒間）遠心分離して、チューブの壁に凝縮した液体を収集してください。

反応液中のDNAまたはRNAを脱リン酸化する場合の酵素濃度

Rocheは次の設定を推奨しています。5'-突出末端には0.5 U/50ピコモル[30分間、37℃]、5'-陥没末端の平滑部には2.0 U/50ピコモル[1時間、50℃]、5'-リン酸を含むRNAには0.5 U/50ピコモル[1時間、50℃]。

脱リン酸化の失敗

上記の反応条件下で特定の核酸が脱リン酸化されない場合は、Mg²⁺濃度を高くして、スペルミジンを使用してみてください。5ピコモルの5'-リン酸末端の場合は、10 mM MgCl₂、0.5 mMスペルミジン、0.01 mM EDTA、および0.1 mM ZnSO₄を含んだ10 µLの50 mM Tris-HCl/pH8.0に核酸を室温で溶解します。スペルミジン-DNA複合体は、冷却すると沈殿するため、氷上には置かないでください。0.5 U AP（1 µL）を加えて、反応ミックスを37℃で30分間インキュベートします。APの2番目のアリコート（0.5 U）を付加し、さらに30分間インキュベートします。APを不活性化するには、サンプルを68℃で20分間加熱し、1 µLの0.25 M EGTA（pH 7.8）を加え、68℃でさらに20分間インキュベートします（2回の加熱ステップを通じて、68℃で10分ごとに数秒間サンプルチューブを遠心分離して、チューブ壁から結露を取り除き、スペルミジン-DNA複合体の沈殿を防ぎます）。