ホップおよび大麻中のテルペンのヘッドスペースSPME-GC/MS分析

Katherine K. Stenerson, Principal Scientist

 Article from Analytix Reporter - Issue 3

本アプリケーションでは、ヘッドスペース-SPMEを用いて、 GC/MS により、一般的なホップおよび大麻の中に存在する数種のテルペン類の分析を行いました。

テルペン類は、ある種の植物によって合成される小さい分子です。テルペンの名前は、これらの化合物を高濃度で含むテルペンチンに由来します。テルペンの分子は、イソプレン単位を頭部―尾部まで結合した構造をしています（図1）。その上で、構造中におけるそれらのイソプレン単位の数で分類がされています（表1）。テルペン類の構造は環状または開放型の可能性があり、二重結合および水酸基、カルボニル基あるいは他の官能基を含んでいるものもあります。CとH以外の元素を含むテルペンはテルペノイドと呼ばれます¹。

図1. 1単位あたり

表1. テルペン類の分類

分類	イソプレン単位の数
モノテルペン	2
セスキテルペン	3
ジテルペン	4
トリテルペン	6
テトラテルペン	8

テルペン類は植物由来の精油中に存在し、植物あるいはその精油に特徴的な香りを発することが多くあります。例えば、d-リモネンは、レモン、オレンジ、キャラウェーや他の植物油中に見いだされるものですが、レモンのような香りを持ちます。精油は、その成分であるテルペンやテルペノイドとともに、不安神経症、うつ病、不眠症などの状態を緩和するためのアロマテラピーとして知られる医療に用いられています²。ここからさらに、これらの化合物を含有する植物を利用して、油、茶、強壮剤などの製品の製造が行われています。

テルペンのプロファイルを用いた植物の同定

大麻草（アサあるいはマリファナ）（cannabis sativa ）は、モノ、セスキ、ジ、トリおよびその他のテルペノイド起源の雑多な化合物を含む100種類超のテルペンおよびテルペノイドを含有しています³。テルペンのプロファイルは必ずしも大麻試料の地理的起源を示すものではありませんが、さまざまな試料に共通するオリジンを決める鑑識用途に使用できます⁴。さらに、特定のテルペンの存在量が異なっているために明確に異なる香りと風味を持つ、別の大麻種が開発されました⁵。ホップ（普通のホップ）（Humulus lupulus ）と大麻はどちらもアサ科の植物⁶なので、それぞれが含有するテルペン類には類似点があります。テルペン類により、どちらの植物製品も感覚器官を刺激する特徴的な特性を持ち、大麻の場合は、つぼみを加熱あるいは蒸発させたときに特徴的な香りを発します⁷。

実験

乾燥大麻の試料は、国立衛生研究所にある米国国立薬物乱用研究所、化学生理学システム研究部門のプログラムディレクターであるHari H. Singh博士の厚意で入手しました。その試料の抽出種は不明でした。品種が不明のホップの花はオンラインで購入しました。ペレット化したカスケードとUSゴールディングホップ変種は、地元の自家醸造用品店で購入しました。クロマトグラフィー分離はEquity^™-1キャピラリーGCカラムで実施し、同定は保持指数とスペクトルライブラリーとの照合によって行いました。最終的な分析条件を図中に示します。

SPME法の最適化

乾燥ホップ花（10 mLバイアルに0.2 g）試料を使ってSPME法を開発しました。最初のSPMEパラメーターは以前に公開した研究に基づくものでした⁸。本分析でのGC/MS結果を図2に示します。最初の一連のパラメーターでは、100μmのPDMSファイバー、1 gの試料サイズ、抽出前に室温での60分平衡化を使用しました。試料サイズをその後0.2 gに減らし、平衡温度を40ºCに上げました。この温度上昇により平衡時間は60分から30分に短縮されましたが、感度の損失はありませんでした（図3および4）。使用した最初の抽出時間は20分で、10分に短縮した場合も評価しましたが、感度の損失が見られたので抽出時間は20分のままとしました。次いで、DVB/CAR/PDMSファイバーを評価しました（図5）。予想通り、このファイバーで多く抽出されたのは軽い方の化合物で、これはMSスペクトル照合により短鎖アルコールおよび酸と同定されました。

図2. 乾燥ホップ花のヘッドスペースSPME-GC/MS分析（100 μm PDMSファイバー、1 g試料）

試料／マトリックス：	粉砕したホップの花1 g
SPMEファイバー：	100 µm PDMS （57341-U）
試料平衡化：	60分、室温
抽出：	20分、ヘッドスペース、40℃
脱着プロセス：	3分間、270℃
ファイバーポストベーク：	3分間、270℃
カラム：	Equity™-1, 60 m x 0.25 mm I.D., 0.25 µm （28047-U）
オーブン：	60℃（2分）、5℃／分で275℃まで（5分）
注入温度：	270 ℃
検出器：	MSD
MSDインターフェース：	300 ℃
スキャン範囲：	フルスキャン、m/z 50～500
キャリアガス：	ヘリウム、1 mL／分、一定流量
ライナー：	0.75 mm ID SPME

図3. 乾燥ホップ花のヘッドスペースSPME-GC/MS分析（100 μm PDMSファイバー、0.2 g試料）

以下を除き図2と同じ条件：

試料／マトリックス：粉砕したホップの花0.2 g

図4. 乾燥ホップ花のヘッドスペースSPME-GC/MS分析、試料平衡化温度上昇（100 μm PDMSファイバー、0.2 g試料）

以下を除き図2と同じ条件：
試料／マトリックス：	粉砕したホップの花0.2 g
試料平衡化：	30分間、40℃

図5. 乾燥ホップ花のヘッドスペースSPME-GC/MS分析、試料平衡化温度上昇（DVB/CAR/PDMSファイバー、0.2 g試料）

以下を除き図2と同じ条件：
試料／マトリックス：	粉砕したホップの花0.2 g
SPMEファイバー：	50/30 µm DVB/CAR/PDMS （57298-U）
試料平衡化：	30分間、40℃
試料／マトリックス：	粉砕したホップの花0.2 g
試料平衡化：	30分間、40℃

GC/MSを用いたテルペン類の同定

最適化したSPME法でDVB/CAR/PDMSファイバーを用いて、ホップと大麻の試料を分析しました。ピーク同定は、MSスペクトルをWileyおよびNISTのライブラリーにある基準スペクトルを検索にかけて同定しました。確認同定は保持指数に基づいて行いました。保持指数は、同じGC条件で分析したn-アルカン標準品を用い、各試料で同定された化合物に対して計算しました。このデータを公開された値（表2および3）と比較し、図6および7に示すように最終同定を割り当てました。

ホップ試料中のテルペン類

乾燥ホップ花試料（図5）のテルペンプロファイルには、ホップおよびホップ油の代表的な芳香化合物であるβ-ミルセン、フムレンおよびカリオフィレンが圧倒的に多く見られるはずでした⁹。カリオフィレンは同定されましたが、β-ミルセンとフムレンはライブラリー検索で検出するのに十分な濃度では存在していませんでした。これは試料の状態か、または分析したホップの実際の品種によるのかもしれません。というのも、テルペンプロファイルはさまざまなホップの品種によって異なることが知られているからです¹⁰。分析したホップ花の品種は、包装に記述がなかったので不明です。比較のため、ペレット化したもう二種のホップ品種を粉砕して分析を行いました。

これらの試料は緑色で、乾燥花よりはるかに特徴的なホップのような香りを発していました。これらの試料を分析したところ、いずれにも、高濃度のβ-ミルセン、カリオフィレンおよびフムレンという特徴的なテルペンプロファイルが見られました（図6）。SPME法で、2種類のホップ品種間のテルペンプロファイルの違いを検出できました。例えば、カスケードホップではファルネセン（ピーク18）が同定されましたが、USゴールディング試料ではシグナルが小さすぎて確認できませんでした。カスケードホップのファルネセン濃度は全オイルの3～7%と予想されますが、USコーディングでは1%未満のはずです¹³。

大麻試料中のテルペン類

大麻試料（図7）中で同定されたテルペン類を表3に示します。プロファイルは、以前に行った乾燥大麻の分析で見られたものと同様でした^4,8。図7のピーク1～27（ピーク7を除く）は、モノテルペン類およびモノテルペノイドでした。後から溶出するピークは、セキテルペン類およびカリオフィレン酸化物（セキテルペノイド）で構成されていました。最も多かったテルペンはカリオフィレンでした。この化合物が圧倒的に多かったのは、試験した特定の大麻種によるものか、試験した試料の性質（乾燥試料）によるものと思われました。以前の研究では、乾燥によってこの化合物の濃度が他のテルペン類およびテルペノイドより著しく増加することが示されていました⁴。そのため、揮発性が高いモノテルペン類およびテルペノイドの濃度が下がると予想され、これはある程度確認されました。モノテルペン類およびテルペノイドのなかで最も多かったのはα-ピネンとd-リモネンでした。

表2. ホップペレット中のテルペン類。MSスペクトルライブラリー照合および保持指数で同定。

ピークNo.	RT（分）	名称	RI（計算）	RI（文献）	参考文献
1	8.58	ヘキサナール	—	780	11
2	12.84	α-ピネン	939	942	11
3	13.28	カンフェン	953	954	11
4	13.71	6-メチル-5-ヘプテン-2-オン	966	968	11
5	14.1	β-ピネン	979	981	11
6	14.41	β-ミルセン	988	986	11
7	15.32	サイメン	1018	1020	11
8	15.65	d-リモネン	1030	1030	11
9	15.98	β-オシメン	1041	1038	11
10	16.72	cis-リナロールオキサイド	1066	1068	11
11	17.49	リナロール	1089	1092	11
12	21.86	ゲラニオール	1239	1243	11
13	25.28	酢酸ゲラニル	1363	1364	11
14	25.85	α-イランゲン	1384	1373	8
15	25.97	α-コパエン	1388	1398	11
16	27.22	カリオフィレン	1437	1428	11
17	27.4	trans-α- ベルガモテン + 不明	1445	1443	12
18	17.63	trans-β- ファルネセン	1454	1450	8
19	28.11	フムレン	1473	1465	11
20	28.41	γ-ムウロレン	1484	1475	11
21	28.45	γ-セリネン	1486	1472	12
22	28.68	ゲラニルイソブチラート	1495	1493	11
23	28.79	β-セリネン	1499	1487	8
24	28.94	α-ムウロレン	1505	1500	11
25	28.97	α-セリネン	1507	1501	12
26	29.31	γ-カジネン	1521	1518	11
27	29.37	カラメネン	1524	1518	11
28	29.45	Δ-カジネン	1527	1524	11
29	30.93	酸化カリオフィレン	1590	1584	8
30	31.5	酸化フムレン	1614	1599	12

図6. ホップペレットのヘッドスペースSPME-GC/MS分析。

ピーク溶出順は表2に記載。
以下を除き図2と同じ条件：
試料／マトリックス：	粉砕したホップの花0.5 g（ホップペレット）
SPMEファイバー：	50/30 µm DVB/CAR/PDMS（57298-U）
試料平衡化：	30分間、40℃

図7. 乾燥大麻のヘッドスペースSPME-GC/MS分析

ピーク溶出順は表3に記載。
以下を除き図2と同じ：
試料／マトリックス：	粉砕した乾燥大麻0.5 g
SPMEファイバー：	50/30 µm DVB/CAR/PDMS (57298-U)
試料平衡化：	30分間、40℃

表3. 乾燥大麻中のテルペン類。MSスペクトルライブラリー照合および保持指数で同定。

ピークNo.	RT（分）	名称	RI（計算）	RI（文献）	参考文献
1	8.57	ヘキサナール	—	—	—
2	10.05	ヘキセン-1-オール	—	—	—
3	10.89	2-ヘプタノン	—	—	—
4	12.56	α-ツジェン	928	938	11
5	12.86	α-ピネン + 不明	939	942	11
6	13.27	カンフェン	953	954	11
7	13.69	6-メチル-5-ヘプテン-2-オン	966	968	11
8	14.09	β-ピネン	979	981	11
9	14.27	β-ミルセン	984	986	11
10	15.09	δ-3-カレン	1010	1015	12
11	15.2	α-テルピネン	1014	1012	12
12	15.29	サイメン	1018	1020	11
13	15.6	d-リモネン	1028	1030	11
14	16.42	γ-テルピネン	1056	1057	11
15	16.6	trans-サビネンハイドレート	1062	1078	11
16	16.72	cis-リナロールオキサイド	1066	1068	11
17	17.43	リナロール	1087	1092	11
18	18.04	d-フェンキルアルコール	1107	1110	11
19	18.82	trans-ピノカルべオール	1135	1134	12
20	19.59	ボルネオールL	1161	1164	11
21	19.81	1,8-メタノインデン-4-オール	1168	1173	8
22	19.81	p-シメン-8-オール	1168	1172	12
23	19.92	テルピネン-4-オール	1172	1185	11
24	20.22	α-テルピネオール	1181	1185	11
25	24.2	ピペリテノン	1322	1320	12
26	24.76	酸化ピペリテノン	1344	1352	12
27	25.85	α-イランゲン	1384	1373	8
28	25.97	α-コパエン	1388	1398	11
29	26.76	γ-カリオフィレン	1419	1403	12
30	27.01	α-サンタレン	1429	1428	12
31	27.16	カリオフィレン	1435	1428	11
32	27.36	trans-α- ベルガモテン + 不明	1443	1443	12
33	27.49	α-グアイエン	1448	1441	8
34	27.56	trans-β- ファルネセン	1451	1446	12
35	27.98	フムレン	1467	1465	11
36	28.17	アロアロマデンドレン	1475	1478	11
37	28.25	α-クルクメン	1478	1479	12
38	28.75	β-セリネン	1497	1487	8
39	28.97	α-セリネン	1507	1497	8
40	28.97	β-ビサボレン	1507	1506	8
41	29.13	α-ブルネセン	1514	1513	12
42	30.12	セリナ-3,7(11)-ジエン	1556	1542	12
43	30.94	酸化カリオフィレン	1590	1595	12
44	31.5	酸化フムレン	1614	1599	12
45	32.48	カリオフィラ-3, 8(13)-ジエン-5-オールA	1658	1656	12

結論

簡単なヘッドスペースSPME-GC/MS法を用いてホップおよび大麻のテルペン／テルペノイドプロファイルを分析しました。その方法で、どちらの試料にも特徴的なテルペン類およびテルペノイドの検出ができ、さまざまなホップ品種間の違いを見分けることができました。

参考文献

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