Fehérje meghatározás Módosított Lowry-módszer

1. CÉL

A fehérje módosított Lowry módszerrel történő meghatározására szolgáló eljárás szabványosítása.

2. HATÓKÖR

Ez az eljárás minden olyan termékre vonatkozik, amely specifikációval rendelkezik a Lowry-fehérje meghatározására triklór-ecetsav (TCA) kicsapás nélkül.

3. DEFINÍCIÓK

Tisztított víz - deionizáló rendszerből, ellenállás > vagy = 18 MΩ-cm @ 25 °C

4. MEGJEGYZÉS

Réz + fehérje	Lúgos pH   >	Réz-fehérje komplex
Fenol reagens

5. FELELŐSSÉGEK

Az Analitikai Szolgálat laboratóriumi személyzetének felelőssége, hogy ezt az eljárást az írásba foglaltak szerint kövesse.

6. BIZTONSÁGOSSÁG

A veszélyek és a megfelelő kezelési óvintézkedések tekintetében olvassa el a biztonsági adatlapot (SDS).

7. ELJÁRÁS

7.1 FELTÉTELEK:

T = 25 °C, A_750nm, fényút = 1 cm

7.2 MÓDSZER:

Kolorimetrikus

7.3 REAGENSEK:

7.3.1 0,85%-os nátrium-klorid-oldat (NaCl) Használjon nátrium-klorid-oldatot, 0.85%-os, Termékszám S0817, vagy készítsen 100 ml-t tisztított vízben nátrium-klorid, Termékszám S9888 felhasználásával.

7.3.2 0,01%-os Lowry fehérje standard (WPS) Készítsen 10 mL-t a 7.3. reagensben.1-re a P0914 termékszámmal vagy a "Working Protein Standard előkészítése fehérjemeghatározáshoz" (10-30-6802-es működési eljárás) szerint készített munkafehérje-standarddal.

7.3.3 Módosított Lowry-reagens (LOW) Készítsen elő tisztított vízben történő feloldással, a címke utasításai szerint, egy injekciós üveget a Lowry Reagent, Modified, Termékszám L1013 vagy termékszám L3540 . Ez az oldat körülbelül egy hónapig tárolható, vagy amíg az oldat zavarossá nem válik.

7.3.4. Fehérjemintaoldat (minta) Készítsen 10-100 mg fehérjét/mL mintát tartalmazó oldatot a 7.3.1. reagensben.

7.3.5. 0. oldat.33 N Folin & Ciocalteu's Phenol Reagent (F&C) Készítsen oldatot 2 N Folin & Ciocalteu's Phenol Reagent (pl. termékszám F9252) 6-szoros hígításával, tisztított vízben. Alaposan keverjük össze.

7.4. Vizsgálati módszer

Gátlási reakció

Pipettázzuk (milliliterben) a következő reagenseket egy megfelelő tartályba:

	Teszt	Std 1			Std 2	Std 3	Std 4	Std 3	Std 4	Std 5	Üres
Reagens 7.3.1 (NaCl)	-----	0.90	0.70	0.50	0.30	-----	1.00
Reagens 7.3.2 (WPS)	-----	0.10	0.30	0.50	0.70	1.00	-----
Reagens 7.3.3 (LOW)	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00
Reagens 7.3.4 (Minta)	1.00	-----	-----	-----	-----	-----	-----	-----	-----

Keverjük össze alaposan, és inkubáljuk 10 percig 25 °C-on. Az inkubációs időnek legalább 10 percnek kell lennie, hogy a rézoldat reagálhasson a peptidkötésekkel. Ez az idő szükség esetén akár 24 óra is lehet.
Ezután adjuk hozzá:

	Teszt	Std 1			Std 2	Std 3	Std 4	Std 3	Std 4	Std 5	Üres
Reagens 7.3.5 (F&C)	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50

Keverjük össze alaposan, és inkubáljuk 30 percig 25 °C-on. Az inkubációs időnek legalább 30 percnek, de legfeljebb 60 percnek kell lennie, mert a színfejlődés 30 perc után is folytatódik. Minden standard, minta és vak abszorbanciaértéket rövid időn belül le kell olvasni a spektrofotométeren.

Az oldatokat megfelelő küvettákba kell átvinni, és a teszt, a standardok és a vakpróbák A_750nm -jét megfelelő spektrofotométerrel kell feljegyezni.

7.5 KALKULÁCIÓK

ΔA_750nm Standard = A_750nm Standard - - A_750nm Blank
Készítsünk standardgörbét a standardok ΔA_750nm -jének és a standardok ΔA_750nm -jének függvényében. mg fehérje ellenében.
Minta meghatározása:
ΔA_750nm Test = A_750nm Test - A_750nm Blank
Határozza meg a mg fehérjét a standardgörbe alapján.
mg fehérje = (mg fehérje a standardgörbéből) * (df)
df = hígítási tényező

% fehérje =	(mg fehérje) * (100)
(mg szilárd anyag/ml)

100 = Átváltás százalékra

mg fehérje/mL	(mg fehérje)
(ml minta/mL)

100 = Átváltás százalékra

8. HIVATKOZÁSOK ÉS MELLÉKLETEK

1. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall R. 1951. J. Biol. Chem.(193):265-275.

2. Peterson G. 1979. Analytical Biochemistry.(100):201-220.

9. JÓVÁHAGYÁS

	Névjegy	Szignó neve	Cím	Dátum
Elkészítette::	Holly Chapman	Holly Chapman	Originator	11/9/04
Approved by:	Rodney Burbach	Rodney Burbach	Supervisor, Analytical Services	11/10/04
Approved by:	Gene McNaughton	Gene McNaughton	minőségbiztosítás	11/10/04