Genomszerkesztés növényekben CRISPR/Cas9 segítségével
Sikeres ZFN-indukált géncélzást már 2003-ban publikáltak. Azóta a célzott genomszerkesztési technológia gyorsan fejlődött, és kereskedelmi forgalomban is elérhetővé vált. Legutóbb a CRISPR/Cas9 útvonal felfedezése gyorsította fel az érdeklődést ezen a területen, új lehetőségeket nyitva a kutatás és fejlesztés előtt. Bár a CRISPR útvonalat baktériumokban azonosították egy feltételezett adaptív immunrendszer részeként, gyorsan adaptálták az eukarióta genomok módosításának céljára. Bár az olyan eszközök, mint a ZFN-ek megteremtették a mai genomszerkesztés alapjait, ennek az alapító technológiának és a hozzá hasonlóknak vannak korlátai: a ZFN-ek fehérje:DNS kölcsönhatása bonyolulttá teszi a tervezésüket, a ZFN-expressziós konstrukció összeállítása időigényes, és a ZFN célzási lehetőségei számos A-T-ben gazdag növényi genomban korlátozottak. A CRISPR útvonal, ahogyan azt az eukarióta genomszerkesztéshez átvették és módosították, számos ilyen akadályt leküzd: a genomi célpont megtalálása RNS:DNS kölcsönhatásra támaszkodik, az ehhez a kötődési eseményhez szükséges felismerő szekvencia egy könnyen módosítható 18-20 bázispár, és a nukleáz kötődés egyetlen követelménye a célpont melletti NGG jelenléte. A CRISPR/Cas9 növényekben történő alkalmazásáról szóló első jelentések, amelyekben tranziens expressziós próbákat tanulmányoztak Agrobacterium segítségével, 2013-ban jelentek meg. A CRISPR/Cas9 technológiát sikeresen alkalmazták modellnövényekben (Nicotiana benthamiana, Arabidopsis thaliana) és haszonnövényekben (rizs, búza), és a lista egyre bővül.
- CRISPR/Cas9: Mi ez és hogyan működik?
- A CRISPR/Cas9 genomszerkesztésre való alkalmazásának előnyei
- Egyszerűsített munkafolyamat: CRISPR/Cas9 növényekben
- >Készen álló Cas9 és vezető RNS (gRNS) expressziós plazmidok monokotikus és dikotikus növényekhez
- Egyedi CRISPR/Cas9 növényi termékek
CRISPR/Cas 9: Mi az és hogyan működik?
CRISPR a Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (klaszterezett, szabályos szóközű rövid palindromos ismétlődések) rövidítése. A II. típusú prokarióta CRISPR "immunrendszer" felfedezése lehetővé tette egy olyan RNS-vezérelt genomszerkesztő eszköz kifejlesztését, amely egyszerűen, könnyen és gyorsan alkalmazható. A CRISPR/Cas9 rendszer egyetlen monomer fehérjéből és egy kiméra RNS-ből áll. A gRNS-ben lévő 20 nt szekvencia szekvencia-specifikus jelleget kölcsönöz, a hasítást pedig a Cas9 fehérje közvetíti. A gRNS-alapú hasítás alapja a cél-DNS-szekvenciával való Watson-Crick bázispárosodás, ami szükségtelenné teszi az egyes célpontokhoz szükséges kifinomult fehérjeépítést. A gRNS-ben csak egy 20 nt-ot kell módosítani ahhoz, hogy megkönnyítsük egy másik célpont felismerését.
A CRISPR/Cas9 egy Cas9 fehérjéből, egy CRISPR RNS-ből (crRNS) és egy transz-aktiváló crRNS-ből ( tracrRNS) áll. A génszerkesztési alkalmazásokban a crRNS-t és a tracrRNS-t gyakran egyetlen vezető RNS-be (sgRNS) fuzionálják. A ribonukleoprotein a crRNS vezető szekvenciával behatol a célpontba, egy 20 bp hosszúságú RNS/DNS hibridet képezve és az ellentétes DNS-szálat kiszorítva, miután találkozik egy protospacer szomszédos motívummal (PAM), például NGG-vel. A Cas9 endonukleáz ezt követően egy HNH nukleáz doménnel hasítja a komplementer DNS-szálat (célszál), és egy RuvC-szerű nukleáz doménnel a kiszorított DNS-szálat (nem célszál), kettős szálszakadás (DSB) létrehozása érdekében. A DSB gazdasejt általi, nem-homológ végcsatlakozási (NHEJ) vagy homológia irányított javítási (HDR) útvonalakon keresztül történő javítása felhasználható génkiütés létrehozására vagy specifikus genetikai módosítás bevezetésére egy DNS-donorral történő homológ rekombináció révén.
A Streptococcus pyogenes-ből származó Cas9 fehérjéből és vezető RNS-ből (gRNS) álló RNS-vezérelt endonukleázok (RGEN) testre szabhatók, mivel csak az RNS-komponenst cserélik ki, ami más génszerkesztési módszerekhez képest munka- és időmegtakarítást eredményez. Vagy Agrobacterium tumefaciens vagy az őket kódoló plazmidok transzfektálásával programozható nukleázok juttathatók növényi sejtekbe, ahol ezek a nukleázok szekvenciafüggő módon hasítják a kromoszómális célpontokat. Az eredmény helyspecifikus DNS kettősszál-törések (DSB-k), amelyek endogén rendszerek általi javítása célzott genommódosításokat eredményez.
A CRISPR/Cas9 használatának előnyei a genomszerkesztésben
A CRISPR/Cas9 fő előnyei az egyszerűség, a hozzáférhetőség, a költség és a sokoldalúság.
A CRISPR/Cas9 rendszer nem igényel semmilyen fehérjemérnöki lépést, így sokkal egyszerűbb több gRNS-t tesztelni az egyes célgénekhez.
A gRNS-szekvenciában csak 20 nt-ot kell megváltoztatni ahhoz, hogy más célspecificitást adjunk, ami azt jelenti, hogy a klónozásra sincs szükség.
Minden gRNS előállítható in vitro átírással, két komplementer lágyított oligonukleotid felhasználásával. Ez lehetővé teszi nagy gRNS-könyvtárak olcsó összeállítását, így a CRISPR/Cas9 rendszer nagy áteresztőképességű funkcionális genomikai alkalmazásokhoz használható.
A CRISPR/Cas9 további előnye a ZFN-ekkel és a TALEN-ekkel szemben a multiplexálás egyszerűsége. A DSB-k több helyre történő egyidejű bevezetése több gén egyidejű szerkesztésére használható. Ez különösen hasznos lehet redundáns gének vagy párhuzamos útvonalak kiütésére. A kutatók nagy genomiális deléciókat vagy inverziókat tudnak létrehozni azáltal, hogy ugyanazon a kromoszómán két, egymástól távol eső hasadási helyet céloznak meg. A CRISPR/Cas9 rendszerrel végzett multiplex szerkesztéshez egyszerűen a monomer Cas9 fehérjére és tetszőleges számú különböző szekvenciaspecifikus gRNS-re van szükség. Ezzel szemben a ZFN-ekkel vagy TALEN-ekkel végzett multiplex szerkesztéshez külön dimer fehérjékre van szükség, amelyek minden egyes célpontra specifikusak.
A CRISPR/Cas9 rendszer képes metilált DNS-t hasítani az emberi sejtekben, ami olyan genomiális módosításokat tesz lehetővé, amelyek a többi nukleáz számára elérhetetlenek. Noha ezt nem vizsgálták kifejezetten növényekben, feltételezhető, hogy a metilált DNS hasításának képessége a CRISPR/Cas9 rendszer sajátja, és nem függ a célgenomtól.
Egyszerűsített munkafolyamat:
A növénybiotechnológia új korszakba lép a genomszerkesztési technológiák bevezetésével, amelyek lehetővé teszik a specifikus genom pontos manipulációját, ezáltal kiszorítva a véletlenszerű mutagenezis régebbi módszereit, mint az EMS mutagenezis és a g-sugárzás szekvenciák. A növényi CRISPR/Cas9 termékeket Agrobacterium-mediált növényi transzformációra vagy biolistás mikrorészecske-bombázásra vagy protoplaszt transzformációra szánják. A termékek a Streptococcus pyogenes-ből származó IIA típusú CRISPR/Cas9-en alapulnak. A natív Cas9 kódoló szekvenciát kodonoptimalizáltuk a monokotákban és dikotákban történő expresszióra. A monokot Cas9 konstrukciók monokot U6 promótert tartalmaznak az sgRNS expressziójához, a dikot Cas9 konstrukciók pedig dikot U6 promótert. A növényi szelekciós markerek közé tartozik a hígromicin B rezisztencia gén, a neomicin-foszfotranszferáz gén és a bar gén (foszfinotricin acetiltranszferáz).
A CRISPR/Cas9-mutagenizált növényi vonal létrehozásának csővezetéke. c, kontroll; m, mutagenizált; RE, restrikciós enzim. A CELI és T7E1 a felmérő vizsgálatban használt DNS-endonukleázok.
Felkész Cas9 és útmutató RNS (gRNS) expressziós plazmidok monokoták és dikoták számára - Növényi CRISPR/Cas9 termékeinket Növényi CRISPR/Cas9 termékekhez szánjuk.Agrobacterium-mediált növényi transzformációhoz vagy bioszisztikus mikrorészecske-bombázáshoz vagy protoplaszt transzformációhoz
- A kodon-optimalizált Cas9 fehérjét és egy gRNS-t egyetlen vektorból fejezzük ki, és felhasználásra kész, transzfekciós minőségű DNS-ként biztosítjuk.
Az Agrobacterium-mediált transzformációhoz használt CRISPR/Cas9 konstrukciók alapvető szerkezete.
A CRISPR/Cas9 konstrukciók alapvető szerkezete a biolitikus vagy protoplaszt transzformációhoz.
Növényi CRISPR/Cas9 terméklista |
|---|
Egyedi CRISPR GUS vektorok |
|---|
Hivatkozások
Az olvasás folytatásához jelentkezzen be vagy hozzon létre egy felhasználói fiókot.
Még nem rendelkezik fiókkal?