Ribonukleoprotein (RNP) protokollok szintetikus sgRNS-ek és Cas9 fehérjék használatával

CRISPR RNP-alapú genomszerkesztési alkalmazások

Noha a CRISPR rendszer plazmidokon keresztül is bejuttatható a sejtekbe, a Cas9 RNP közvetlen bejuttatása erősíti és bővíti a CRISPR genommódosítási technológia alkalmazási lehetőségeit, mivel kiküszöböli a plazmid DNS-nek a gazdagenomba való integrálódásának lehetőségét. Az RNP-komplexek gyorsabb génszerkesztést tesznek lehetővé, mivel a funkcionális nukleáz azonnal elérhető a sejtben, a komplexek pedig gyorsan lebomlanak és kiürülnek, így a szerkesztési aktivitás rövid ideig tart. A sejtekben rendelkezésre álló RNP rövidebb ideje csökkenti a célponton kívüli hatásokat.

1. ábra. A CRISPR egyrészes és kétrészes rendszerek sematikus ábrája a Cas9 fehérjével, a ribonukleoprotein (RNP) összetételét szemléltetve. A kettősszál-törés létrejötte után a sejt DNS-gépezet két lehetséges javítási útvonalat választ; a nem-homológ végcsatlakozást (NHEJ), az indelképzést vagy a homológia által irányított javítást (HDR) a célzott inszerciók vagy knock-inek esetében.

Detapétizált protokollok

Szintetikus vezetőink a génszerkesztési alkalmazások széles körével kompatibilisek. Legyen szó általános felhasználási útmutatókról, nukleofekciós & embriók mikroinjekciójáról, T-sejt szerkesztésről vagy iPSC protokollokról. Segítséget találhat a downstream hasítási hatékonyság értékeléséhez, a klónok izolálásához &; szűréséhez és a hibaelhárításhoz is.

Primer T-sejtek szerkesztése RNP használatával

A ribonukleoprotein (RNP)-alapú genomszerkesztési kísérletek még soha nem voltak olyan egyszerűek, mint a Sigma-Aldrich^® szintetikus szintetikus vezető RNS-ek és Cas9 fehérjék segítségével, azonban egyes sejteket nehezebb szerkeszteni, mint másokat. Kiterjedten validáltuk a reagenseket és protokollokat, hogy a legnagyobb kihívást jelentő alkalmazásokban is működjenek, beleértve a primer T-sejteket, amelyek számos jelentős kihívást jelentenek, amelyeket le kell küzdeni, amikor egy konstrukció vagy gén kiütésére vagy kiütésére teszünk kísérletet. Az sgRNS-ekkel azonban primer humán T-sejtekben olyan hatékonyságú és specificitású szerkesztés érhető el, amely meghaladja a kétrészes útmutató rendszereket (2. ábra az alábbi adatlapon) Mind a primer T-sejtekben, mind a PBMC-kben, hogy biztosak legyünk benne, a Sigma-Aldrich^® sgRNS -ek nagymértékben specifikus párosított nickáz és Cas9 nickáz, vagy egyhelyű SpCas9 fehérje formájában is bevezethetők, hogy a PD-1 gén teljes kiütését érjük el, PD-1 expresszióval és NGS-sel mérve (2. ábra az alábbi adatlapon). Az sgRNS-ek gyorsan tervezhetők bármely génhez akár egyetlen cél-RNS-ként, akár a párosított nikáz rendszer részeként, ideálisak különböző humán sejttípusokhoz, beleértve a primer T-sejteket is. A Cas nukleázok, amikor fehérjeformátumban, egyetlen módosított vezető RNS-szel (gRNS) előkomplexálva, nem pedig plazmidon kódolva kerülnek a kutatókhoz, lehetővé teszik a CRISPR terápiás területen történő használatának történelmileg korlátozó tényezőinek, a célponton kívüli hatásoknak, az alacsony hatékonyságnak és az idegen DNS-re adott nemkívánatos sejtválaszoknak a megkerülését. Ha biztosra kell mennie, a Sigma-Aldrich^® sgRNS-ek az egyetlen olyan vezető RNS-ek, amelyek mögött 100%-os teljesítménygarancia áll - előre megtervezett és egyedi szekvenciák.

2. ábra. A csak egyetlen aktív vágó doménnel rendelkező RNP-nikáz rendszerekkel történő szerkesztés, majd a proximális vezető RNS-ekkel párban történő szállítás pontos kettősszálú töréseket tesz lehetővé, és hiper-specifikus és hatékony genomszerkesztést biztosít a nehezebben szerkeszthető sejttípusokban.

Kipróbált, nagy teljesítményű génszerkesztés egérembriókban

Az egérmodellek létrehozása munkaigényes és költséges folyamat, de létfontosságú az egészség és a betegségek megértését célzó alapkutatásokban. A Sigma-Aldrich^® sgRNS teljesítményét a legmagasabb szinten teszteltük az egérembriókban történő génszerkesztési alkalmazásokhoz, összehasonlítva sgRNS-ünket más vezető szolgáltatókkal több genomiális helyen egérembriókban.

A többszörös ismétlések minden egyes helyen egymás melletti összehasonlításban feltárták az azonos sgRNS-célpontok szerkesztési hatékonyságának különbségeit a Sigma-Aldrich^® és más vezető szolgáltatók között. Egy független, kiemelkedő, egér core facility által párhuzamosan végzett kísérletek azt mutatják, hogy a Sigma-Aldrich^® single guide-ok vágási hatékonyságban fölényes teljesítményt nyújtanak. Ezenfelül nem volt növekedés a toxicitásban az embriók túlélőképességére nézve. Összességében, az adatok azt mutatják, hogy a mi nagy aktivitású és tiszta sgRNS-ünk kiváló génszerkesztést biztosít egy független létesítmény által végzett kísérletekben az embriók mikroinjekciójától vagy elektroporációjától független versenytársakhoz képest.

3. ábra. Az egérembriókban végzett génszerkesztés hagyományosan hosszú folyamat, azonban az RNP-alapú szerkesztés a CRISPR segítségével csökkenti a folyamat bonyolultságát. Egérmodellek gyorsan létrehozhatók, szinte bármilyen célpontra. Szintetikus sgRNS-eink alkalmasak mind az embriók mikroinjekciózására, mind az embriók elektroporációjára.

Kapcsolódó termékek

1. táblázat: Cas9 fehérje termékek

2. táblázat: Egyéb kapcsolódó termékek

EMBRYÓKULTÚRA MÉDIÁK	Egerek embrió tenyésztőközegek és egér embrió tesztelt reagensek
CELLAKULTÚRA		A sejtek és sejtkultúra-reagensek teljes katalógusa

Hibaelhárítás

Ha nem figyelhető meg vágás, és okkal feltételezhető, hogy a kísérlet hibás, a következő szempontok segíthetnek a kísérlet hibaelhárításában.

Vélt probléma	Megoldás
A Cas9 fehérje denaturálódott a hígító pufferben történő hosszú távú tárolás után.		A mellékelt hígító puffer csak azonnali használatra ajánlott. Hosszú távú tárolás esetén a fehérjét liofilizáltan vagy a mellékelt rekonstrukciós oldatban reszuszpendálva -20 ℃-on tartsa.
A Cas9 fehérjét túl sokszor olvasztották fel és fagyasztották újra.	A Cas9 fehérje bizonyítottan többszöri fagyasztást és felolvasztást is kibír a vágási aktivitás feláldozása nélkül, de a fehérje újrafelfüggesztéskor kisebb mennyiségbe történő aliquotálása lehetővé teszi ennek a potenciális problémának az elkerülését.
A crRNS-eket és a tracrRNS-eket a Cas9 fehérjével való komplexképzés előtt lágyítani kell.		Noha a lágyítási lépésre általában nincs szükség, ritka esetekben a vágás fokozódását bizonyította. A crRNS és a tracrRNS lágyításához keverje össze őket a kívánt arányban, és inkubálja az elegyet 5 percig 95 ℃-on, majd tegye az elegyet 20 percre jégre.
A crRNS-ek és a tracrRNS-ek lebomlanak.	Normális sejttenyésztési körülmények között nincs szükség szintetikus RNS-módosításra a stabilizáláshoz; bizonyos sejtvonalak esetében azonban erre szükség lehet. A módosítások nálunk kaphatók.
A transzfekció vagy nukleofekció nem működik vagy túl mérgező.		Minden transzfekciós reagens vagy nukleofekció esetében optimalizálja a protokollt minden egyes használt sejtvonalra. További segítségért olvassa el a gyártó protokollját.
In vitro az átírt RNS rossz minőségű vagy lebomlott.	Az optimális teljesítmény érdekében csak minőségi ellenőrzött IVT RNS-t használjon.