Protokoll útmutató: Organoidok immunfluoreszcens festése antitestek felhasználásával

Az organoidok összetett 3 dimenziós struktúrával rendelkeznek, és beágyazódnak a ECM hidrogélek nehezítve a jellemzést. Az organoidok immunfluoreszcens (IF) festése antitestekkel elvégezhető a sejtek viselkedésének, proliferációjának, differenciálódásának, a sejtek egészségének és identitásának molekuláris markereinek láthatóvá tételére. A teljes immunfestés kis szövetdarabok szeletelése nélküli immunfestésére szolgál, és a módszerek nagyon hasonlítanak a krioszekciók immuncitokémiai (ICC) vagy immunhisztokémiai (IHC) festéséhez. Az organoidok egészben történő festése felhasználható antitest alapú jellemzésre. Ebben az organoid festési protokollban részletezzük az egészben rögzített organoidok rögzítésének, permeabilizálásának és festésének módszereit immunfluoreszcens konfokális mikroszkópiával történő elemzéshez.

1. ábra. Organoidok immunfluoreszcenciája antitestek felhasználásával. Humán epithelialis bél- és tüdőorganoidok, amelyeket acetil-α-tubulin (A), α-karbon anhidráz IV (B) és Sox-9 (AB5535) antitestekkel festettek (C).

Organoid festési protokoll

1. Vegyük ki a táptalajt az organoid kultúrából, és mossuk át óvatosan 2X 1X PBS-szel (D8537).
2. Fixáljon 30-40 organoid Matrigel kupolát egy 10 cm-es tálban 15-20 ml 4%-os PFA-val (1.00496) 30-60 percig szobahőmérsékleten.  
   Figyelem: A Matrigel részben feloldódik, ha PFA-ban rögzítjük. 
3. A Matrigel kupolák leválasztásához és az organoidok Matrigelből való kiszabadításához időnként forgassa meg az edényt. 
   Figyelem: nem minden organoid szabadul ki a Matrigelből.
4. A 10 cm-es tálból a 15-20 ml fixálószert öntse egy 50 ml-es kúpos csőbe, és hagyja, hogy az organoidok a gravitáció hatására a cső aljára ülepedjenek (~10-15 perc). 
5. Miután az organoidok a gravitáció hatására leülepedtek az 50 ml-es kúpos cső aljára, óvatosan szívja le a fixálószert, és próbálja elkerülni, hogy közben az organoid pelletet szívja le. 
6. Adjunk 15-20 ml 1X PBS-t (D8537) a 4. lépésből származó edénybe, és hagyjuk állni 15-20 percig szobahőmérsékleten.
7. Amikor letelik a 15-20 perc, forgassa meg az edényt, hogy a Matrigel-dómok tovább oldódjanak, és öntse az 1X PBS-t (D8537) az 5. lépésből származó organoid pelletet tartalmazó 50 ml-es kúpos csőbe.
8. Ismételje meg az 5-7. lépést még háromszor.
9. Az oldatot az organoid pellet sérülése nélkül légtelenítse, és adjon hozzá 5 mL 1X PBS-t (D8537) az organoid pelletet tartalmazó 50 mL-es kúpos cső oldalára adagolva, és forgassa meg a csövet az organoid pellet reszuszpendálásához.  
   Figyelem: ne pipettázzon fel és le egy pipettával. Ez a legtöbb organoidot összetöri.
10.  Az organoid csomókat tartalmazó 5 ml 1X PBS-t (D8537) közvetlenül öntse a leválasztatlan organoid Matrigel kupolákat tartalmazó 10 cm-es tálba.
11. Adjon további 5 ml 1X PBS-t (D8537) az 50 ml-es kúpos csőbe, hogy a lehető legtöbb organoid csomót összegyűjtse, és közvetlenül az organoidokkal együtt öntse a 10 cm-es tálba.
12. Ha nem használjuk fel azonnal, zárjuk le a 10 cm-es tálat parafóliával, és tároljuk a hűtőszekrényben 4 °C-on legfeljebb 1 hónapig. 
13. Amikor készen állunk az immunfluoreszcens festés elvégzésére, vegyük ki a rögzített organoidokat tartalmazó 10 cm-es tálat a hűtőszekrényből, és vizsgáljuk meg boncmikroszkóp alatt.
14. Vágja le egy 1 ml-es pipettahegy csúcsát úgy, hogy a cső elég nagy legyen az organoidok felszívásához anélkül, hogy megnyírná vagy eltörné őket.
15. Transzferálja az organoidokat (1-4) egy 8 lyukú kamrás tárgylemezre, és távolítsa el a maradék 1X PBS-t (D8537) egy P-200 pipetta segítségével.  Kerülje el az organoidok felszívását és nyírását a vágatlan P-200 hegyén keresztül.
16. Permeabilizáljuk a rögzített organoidokat 0,5 ml blokkoló pufferrel (5% lószérum + 0.5% Triton X-100 1X -ben < 5% >Triton X-100 -ban.a href="/HU/hu/product/sigma/d8537" target="_blank">PBS) egy éjszakán át 4 °C-on vagy 2-4 órán át szobahőmérsékleten.  Figyelem: ajánlott a másodlagos ellenanyag gazdájával azonos fajból származó szérumot használni.
17. A blokkoló puffer eltávolítása az organoidokat tartalmazó kamrás tárgylemezről egy P-200 pipettával.  Kerülje az organoidok felpipettálását a P-200 hegyén keresztül.
18. Készítsen elsődleges antitesteket (300-500 µl) vagy direkt konjugált antitesteket (300-500 µl) a blokkoló pufferben.
19. Adja a hígított antitesteket az organoidokat tartalmazó, megfelelően megjelölt mélyedésbe.
20. Hagyja 4 °C-on inkubálni egy éjszakán át.
21. Másnap mosson 3X 1X PBS-szel (D8537) 10-15 percig minden mosásnál. Megjegyzés: Közvetlen konjugált antitestek használata esetén a minták készen állnak a konfokális mikroszkópon történő képalkotásra.
22. Ha nem konjugált primer antitesteket használ, készítsen másodlagos antitesteket (300-500 µl) blokkoló pufferben és a megfelelően jelölt mintákhoz.
23. A másodlagos antitesttel festést egy éjszakán át 4 °C-on végezzük.
24. Másnap mossunk 3X 1X PBS-szel (D8537) 10-15 percig minden mosásnál.
25. Eltávolítsa a blokkoló puffert minden egyes, az organoidokat tartalmazó mélyedésből egy P-200 pipettával.  Kerülje az organoidok felpipettálását a P-200 hegyén keresztül.
26. Készítse elő a nukleáris festést DAPI (D9542) hozzáadásával 5 µg/ml mennyiségben 1X PBS-ben (300-500 µl mintánként).
27. Adjunk DAPI festőoldatot minden egyes mintához, és hagyjuk, hogy 15-20 percig szobahőmérsékleten inkubálódjon.
28. Mosson 3X 1X PBS-szel (D8537) 10-15 percig minden mosásnál.
29. A minták készen állnak a konfokális mikroszkópon történő képalkotásra.