FFPE 组织

存档的福尔马林固定和石蜡包埋 (FFPE) 组织样本是分析基因表达和研究多种疾病的宝贵资源。由于存档的 DNA 通常数量有限，因此样本的扩增必不可少。由于存档过程导致模板损坏，放大 FFPE 组织可能是一项艰巨的任务。该方案为从 FFPE 组织中纯化和扩增基因组 DNA 提供了方便的方法。GenomePlex^®全基因组扩增已用于扩增大鼠和人类FFPE组织样本的基因组DNA。

注意：以方案描述了 DNA 纯化和随后的全基因组扩增的过程。我们已通过我们的GenomePlex^®组织全基因组扩增试剂盒（货号WGA2+C4482）极大简化了这一过程。该试剂盒包括用于组织破碎和细胞裂解的优化试剂，无需繁琐的有机提取过程，可在扩增前去除多余的石蜡或 DNA 纯化过程。 

所需产品

• GenElute™ 哺乳动物基因组 DNA 小量提取试剂盒（G1N10）
  

由用户提供的材料

• FFPE 组织
• 37 °C 水浴或加热块
• 55 °C 水浴或加热块
• 70 °C 水浴或加热块
• 二甲苯
• 乙醇（E7023）
• 水，分子生物学试剂（W4502）
• 微量离心机（带2 mL管的转子）

从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织中提取DNA
该方案是在大鼠肝组织上进行的。建议在该过程中使用GenElute™哺乳动物基因组DNA小量制备试剂盒（G1N10）。

1. 将一小段 (20 mg) 石蜡包埋组织放入到2 mL微量离心管中。
2. 加入1200 µL二甲苯，涡旋30秒。
3. 室温全速离心 5 min。
4. 移液除去上清液。切勿取出任何颗粒。
5. 向沉淀中加入1200 µL乙醇以除去残留的二甲苯。涡旋混匀。
6. 室温全速离心 5 min。
7. 小心移液除去乙醇。切勿取出任何颗粒。
8. 再次重复步骤 5-7。
9. 将开放的微量离心管在 37°C 培养 10-15 min，通过蒸发除去任何残留的乙醇。
10. 消化组织：将组织块重悬于180 µL裂解液T中。
11. 加入20 µL蛋白酶K。通过涡旋混合。在 55 °C 下培养过夜或直至组织完全裂解。在孵化过程中偶尔涡旋。
    可选的RNase处理：如果担心残留RNA，可加入20 µL RNase A溶液，室温孵育2 min。
12. 裂解细胞：涡旋 15 秒。向样品中加入200 µL裂解液C。对于均匀混合物的彻底涡旋对于有效裂解是必不可少的。在70 °C孵育10分钟。
13. 准备色谱柱：向每个预装GenElute微量提取吸附柱中加入500 µL柱制备液，12,000× g离心1分钟。
14. 结合准备：向裂解的样品中加入200 µL乙醇，涡旋混匀。
15. 加裂解液：从步骤 14 开始将样品管的全部内容物转移到处理过的吸附柱中。 ≥6500 × g离心1分钟。弃去含有流通液的收集管，将吸附柱置于新的2 mL收集管中。
16. 第一次清洗：首次使用前，请按照配制说明书的说明用乙醇稀释洗涤液浓缩液。向吸附柱中加入500 μL洗涤液，并以 ≥6500 × g的转速离心1分钟。弃去含有流通液的收集管，将吸附柱置于新的2 mL收集管中。
17. 第二次洗涤：向吸附柱中再加入500 µL洗涤液，并以最大速度（12,000–18,000 × g）离心3分钟以干燥吸附柱。在洗脱柱上的 DNA 之前，吸附柱不含乙醇至关重要。如果看到残留乙醇，以最大速度将吸附柱再离心一分钟。弃去含有流通液的收集管，将吸附柱置于新的2 mL收集管中。
18. 洗脱 DNA：将200 µL洗脱液直接移入吸附柱中心，室温孵育5 min。≥6500 × g离心1分钟以洗脱DNA。
19. 将DNA样品储存在–20°C。
    注：从第 10 步开始，无需使用二甲苯即可执行此方案。由于省略了二甲苯处理步骤，与采用二甲苯步骤的方案相比，DNA 的量将减少约 50%。

应用数据

GenomePlex^® 全基因组扩增 FFPE 组织

图标符号：产物是通过使用来自我们的GenomePlex^®全基因组扩增试剂盒（WGA1）、供应商A和供应商Q分别扩增得到的。在1.5%琼脂糖凝胶上分离产物。向每孔中加入5 µL扩增产物。与供应商 A 和 Q 相比，使用 GenomePlex 技术扩增的产物分子量较小，这归因于扩增前基因组 DNA 的随机片段化。我们的扩增产物是特异性的，在阴性对照中没有可见的扩增子（泳道 2），表明只有所需的基因组 DNA 被扩增。供应商 A 和 Q 在阴性对照中产生非特异性信号，其大小和强度与供应商阳性对照的信号相等。

泳道 1—1kb 标记	泳道 6—供应商 A 10 ng 输入 DNA
泳道2—我们的阴性对照	泳道7—供应商 A 100 ng 输入 DNA
泳道3—我们的 10 ng 输入 DNA	泳道8—供应商 Q 阴性对照
泳道4—我们的 100 ng 输入 DNA	泳道9—供应商 Q 10 ng 输入 DNA
泳道5—供应商 A 阴性对照	泳道10—供应商 Q 100 ng 输入 DNA

图标符号：从福尔马林固定和石蜡包埋的大鼠肝脏样本中提取 DNA。10 ng和100 ng的基因组DNA是通过使用GenomePlex^® Complete WGA试剂盒（货号WGA2）扩增并然后用GenElute™ PCR纯化试剂盒（NA1020）纯化得到的。使用 12 种不同的引物组对 WGA 反应进行定量 PCR（45 个循环）。与供应商相比，GenomePlex 表现出约 1000 倍 (10 Ct) 更好的代表性。