DNA寡核苷酸是相对稳定的分子（表1）。但是，它们需要一定的操作处理和储存技术，以确保无故障实验和最大限度地延长保质期。
表1.在适当储存条件下，未修饰的单链DNA寡核苷酸的大致保质期。这些值是估计值，不能保证。
重悬、储存和工作习惯
未修饰的DNA
重悬。除非要求在溶液中运输，否则所有单链DNA寡核苷酸都是以干燥形式运输的，只需重悬即可使用，但硫醇修饰的序列除外（请遵循该还原实验方案活化这些寡核苷酸）。优选弱缓冲液，例如TE（10 mM Tris，pH 7.5至8.0，1 mM EDTA）或Tris（10 mM Tris-HCl，pH 8.0），其中TE是最佳选择。如果TE不适合最终技术 / 应用，那么无菌，无核酸酶的水是第二个最佳选择。
储存方法。如表1所示，在-20℃下储存时具有最长保质期。TE缓冲液绝对是最佳选择，因为实验室级水通常是微酸性的，会缓慢降解DNA。此外，干燥的寡核苷酸也永远不是真正干燥的。总会保留一些水分，因此这会导致缓慢降解。然而，无论是干燥的还是在水中或缓冲液中，至少在2年内稳定性都不太可能有任何显著变化。
未修饰的RNA
重悬。单链RNA寡核苷酸应按照上文所述对未修饰DNA的重悬方法重悬。
储存方法。由于其化学结构，RNA不如DNA稳定。RNA容易自催化（图1）和被RNase降解，实验室中到处存在RNase，因为它们存在于脱落的皮肤细胞和普遍存在的微生物等来源中。
图 1.RNA自催化RNA的2'-羟基可导致自催化降解，继而在合适条件下降低有用的寡核苷酸的量。
对于短期储存，单链RNA寡核苷酸应储存于-80 °C下TE缓冲液中。如要长期储存，最好以乙醇沉淀物的形式储存于-80 °C下。采取预防措施尽量避免接触RNases可延长保质期。
使用RNA。RNase通常含有许多二硫键，因此非常稳定。这些酶能抵抗常规消毒方法，例如高压灭菌，因此必须用强化学品才能清除。以下预防措施将有助于最大限度地减少RNA寡核苷酸暴露于RNase：
- 相信工作区 / 实验室中的所有东西都可能存在RNases污染。
- 在实验室中专门隔离一个区域只处理RNA。
- 定期用杀灭RNases的药剂清洁RNA隔离区。
- 使用经认证不含RNase的化学品、试剂和水。
- 使用RNA专用工具，例如微量移液管。
- 始终戴着手套，当接触其他表面后务必更换。
修饰的寡核苷酸
重悬。修饰的寡核苷酸，无论是DNA还是RNA，都应重悬于TE缓冲液中。这十分重要，特别是对于荧光基团，因为pH会对荧光发射强度产生很大影响。
储存方法。修饰的寡核苷酸的稳定性特征应与其所对应的未修饰的DNA和RNA相似。因此，应根据上述对DNA和RNA的建议进行储存。为防止曝光，荧光标记的寡核苷酸应避光保存。
使用荧光修饰。在使用荧光基团时为防止曝光，须将它们置于琥珀色管中，或者用箔包裹的透明管中。
双链寡核苷酸
我们的科学家发现siRNA双链体在-20°C下干燥保存可至少稳定3年。DNA双链体如果不是比这更稳定也应该同样稳定（该值只是估计值，不能保证。如想获得有保证的实验确定的有效期，请我们联系以了解有关稳定性的研究[见下文]）。
一次性等分试样
虽然反复冻融被认为会降解基因组DNA，可能是由于冰晶形成导致的剪切作用1，但我们的科学家们发现寡核苷酸不受这些循环的负面影响。然而，将寡核苷酸等分成一次性等分试样，然后冷冻保存在-20℃下，仍然是最好的做法。这可以防止因交叉污染或泼洒等事故造成的浪费。例如，如果一管寡核苷酸洒到地板上，就得重新订购。然而，如果只是洒了一个等分试样，只需再解冻一支就行了。
制备溶液
试管标签和技术数据表上的寡核苷酸数量使用多种单位，包括光密度（OD）、微克（μg或者μg/OD）和纳摩尔（nmol）。我们的定量方法最开始用UV / Vis分光光度计读取260 nm处的吸光度以提供OD值 — 然后从OD值得出所有其他单位值（如需更多了解，请参见寡核苷酸定量）。这些数量单位均可直接用于制备原液，但其中nmol是最有用的。
有许多浓度单位，但微摩尔（μM）可能是寡核苷酸最常用的单位。在这里，作为一个示例，我们将从试管标签 / 技术数据表中给出的nmol数量开始，用详细步骤和快捷公式计算出制备100 μM原液以及10 μM工作溶液所需的量。如想更快算出结果，包括其他单位的浓度的计算，请使用OligoEvaluator™的重悬和稀释模块。
重悬的详细步计算示例
在尺寸计算时，为了避免换算混淆，我们使用基本单位。直接在nmol、μM和其他非基本单位之间进行换算很容易出错。
步骤1.将试管标签/技术数据表上的nmol数换算为摩尔数。
我们假设的寡核苷酸数量为49.9 nmol。
mol = 49.9 nmol x 1 mol 109 nmol-1
mol = 4.99 x 10-8
步骤2.将所需的100 μM原液浓度换算为摩尔浓度。
100 µM = 100 µmol L-1
M (mol L-1) = 100 µmol L-1 x 1 mol 106 mol-1
M (mol L-1) = 1 x 10-4
步骤3.使用所需原液的摩尔浓度以及摩尔数来计算重悬所需的体积升数。
1 x 10-4 mol L-1 = 4.99 x 10-8mol
L = 4.99 x 10-8mol / 1 x 10-4mol
L = 4.99 x 10-4
步骤4.将升换算为微升（μL）。
体积 = 4.99 x 10-4 L x 106 µL L-1
体积 = 4.99 µL
重悬的快捷计算示例
步骤1.从试管标签/技术数据表中读取nmol量，然后乘以10，得到重悬体积的微升数。
体积 = 4.99 nmol x 10
体积 = 499 µL
此快捷计算只用于制备100 µM溶液。
在本例中，向含有寡核苷酸的试管中加入499 μL水或缓冲液，然后涡旋以确保充分混合。
关于重悬的补充说明
上述重悬示例中使用了100 μM，因为它是典型的实验室原液浓度。如果制备的原液浓度远低于100 μM，则可能会有问题，因为这样会使重悬所需的体积很容易超过试管的2 mL容量。例如，如要制备示例中的这种寡核苷酸（49.9 nmol）的20 μM原液，则需要添加2.49 mL水或缓冲液。
同样，如果制备浓度高于100 μM的原液也有问题。例如，如要制备示例中的这种寡核苷酸的1000 μM原液，则需要添加49.9 µL水或缓冲液。从2 mL试管中精确移液这么小的体积会很困难。
如果制备100 μM的原液，实际上都不需要计算，也不需要在线工具，因为技术数据表上就给出了重悬所需的量。
工作溶液计算的示例
在这个示例中，我们假设最终的10 μM工作溶液的体积为20 μL，这个是PCR所用的典型体积。
步骤1.使用浓度体积公式。
C1V1 = C2V2
100 µM x V1 = 10 µM x 20 µL
V1 = 2 µL
在本示例中，将2 μL原液加入到反应管中，并与其他组分一起，用水或缓冲液定容至20 μL。
参考文献
如要继续阅读，请登录或创建帐户。
暂无帐户？